Структурно-функциональная организация домена альфа-глобиновых генов кур

• Автор: Юдинкова, Елена Станиславовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 181 с. : ил.

1. Области контроля локуса различных геномных доменов.

2. Ипсуляторы.

IV. ГЕНОМНЫЕ ДОМЕНЫ С РАЗМЫТЫМИ ГРАНИЦАМИ

1. Что такое геномные домены с размытыми границами.

2. Можно ли картировать домен, если тест на предпочтительную чувствительность к ДНКазе I не работает.

3. Регуляция экспрессии генов в доменах с невыраженными границами.

V. ХРОМАТИНОВЫЕ ДОМЕНЫ.

VI. ДОМЕНЫ АЛЬФАГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ ПОЗВОНОЧНЫХ

1. Хромосомная локализация

2. Структура домена.

3. Пространственная организация домена

4. Ген домашнего хозяйства
5. Организация хроматина
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Работа с культурами клеток.
2. Работа с ДНК и РНК.
3. Гибридизация i i.
4. Приготовление олигоиуклеотидных матриц.
5. Связывание i vi фрагментов ДНК с препаратами ядерного матрикса.
РЕЗУЛЬТАТЫ
I. СТРУКТУРА ДОМЕНА АЛЬФАГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.
1. Определение границ домена альфаглобиновых генов кур методом картирования участков гиперчувствительности к ДНКазе
2. Клонирование и характеристика Зкоицевой области домена альфаглобиновых генов кур
3. Идентификация островка перед кластером альфаглобнновых
генов кур
4. Характеристика неклонируемой последовательности ДНК, локализованной в интергенном спейсере между л и глобиновыми
генами курицы
И. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА
АЛЬФАГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.
1. Крупномасштабная организация хроматина в домене альфаглобиновых
генов кур, выявленная с использованием олигонуклеотидных матриц.
2. Подтверждение позиций участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу с использованием метода флуоресцентной гибридизации
i i I с препаратами ядсрных гало.
3. Гибридизация прилежащей к ядерному матриксу фракции ДНК с олигонуклеотидными ДНКчипам и позволяет картировать позиции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу в протяженных
областях генома
4. Пространственная организация домена альфаглобиновых генов кур
в различных типах дифференцированных клеток
III. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕЭРИТРОИДСПЕЦИФИМНОГО ГЕНА,
РАСПОЛОЖЕННОГО В ДОМЕНЕ АЛЬФАГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР,
АНАЛОГА ГЕНА ЧЕЛОВЕКА.ПО
1. 5фланкирующая область домена альфаглобиновых генов кур
содержит участки гомологии с геном человека
2. Характер транскрипции 5фланкирующей области домена альфаглобиновых генов кур
IV. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ДЛИННЫХ ТРАНСКРИПТОВ
В ДОМЕНЕ АЛЬФАГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.
1. Определение протяженности и непрерывности транскрипта
2. Транскрипционная единица доменного уровня начинается в области БСИподобного регуляторного элемента домена
альфаглобиновых генов кур.
3. Протяженные транскрипты присутствуют в эритробластах,
но не в фибробластах.
4. Полнодоменные транскрипты являются составной частью
ядерного матрикса.
V. ХАРАКТЕРИСТИКА НЕГАТИВНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ РАБОТУ ДОМЕНА АЛЬФАГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР
1. Анализ функциональной активности фрагментов из кластера участков гиперчувствительности к ДНКазе I, локализованного
на расстоянии .5 т.п.н. перед ягеном
2. Кластер участков гиперчувствитсльности к Д Казе I, локализованный
на расстоянии .5 т.п.н. перед ягеном, колокализуется с островком, часть которого избирательно метилирована в неэритроидных клетках.
3. Анализ функциональной активности эр фрагмента
4. островок из домена альфаглобиновых генов кур не содержит сигналов, достаточных для поддержания его неметилированного статуса
в геноме трансгенных мышей.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Геномные домены открытого типа.
2. Новый метод изучения пространственной организации протяженных геномных доменов
3. Молекулярные механизмы, активирующие работу глобииовых
генов в эритроидных клетках
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ


В настоящее время схема поэтапной активации генов сначала на уровне хроматинового домена, а потом на уровне индивидуальных промоторов является общепризнанной. Изменение чувствительности к ДНКазе I в зависимости от типа клеточной дифференцировки характерно и для доменов ряда других тканеспецифичных генов. Так, домен гена лизоцима кур характеризуется повышенной чувствительностью к ДНКазе I в клетках макрофагов и относительной резистентностью к ДНКазе в других типах клеток. ДНКазачувствительная область включает в себя транскрипционную единицу размером 4 т. Переход к ДНКазаустойчивой конфигурации хроматина достаточно постепенный с 5стороны и резкий в 3области, как и в случае доменов генов овальбумина . Рисунок 2. Модель образования чувствительных к ДНКазе I доменов во время клеточной дифференцировки комментарий в тексте . Феномен повышенной чувствительности к ДНКазе I обычно объясняют переходом нм хроматиновой фибриллы в так называемую развернутую структуру типа бусинок на нити. Постепенное изменение чувствительности на границе может быть связано с тем, что в популяции клеток изменение конформации хроматиновой фибриллы начинается в разных точках в пределах некоторой зоны на молекуле ДНК. Помимо обшей повышенной чувствительности к ДНКазе I существуют так называемые участки гиперчувствительности к этому ферменту. Как правило, это свободные от нуклеосом участки, в которых расположены разные регуляторные последовательности. В домене гена лизоцима цыпленка участки гиперчувствительности к ДНКазе I расположены кластерами перед и после транскрипционной единицы, за одним исключением, и все в границах домена. Наличие гиперчувсгвительных сайтов на достаточном расстоянии от гена, но внутри домена указывает на возможность контроля экспрессии из отдаленных районов. Тейсена ТЬе1еп сх. Гревала Огеша1 сХ. Домен бетаглобиновых генов кур необычен с точки зрения расположения генов и компактности Рис. Т.П. Рисунок 3. Схематическое изображение домена бетаглобиновых генов кур. Гены расположены в следующем порядке 5рр рАе3 расположенные в центре гены взрослых животных рм и рА окружены эмбриональным геном р и фетальным геном е Vi . Согласно гипотезе К. Шеррера о том, что АТбогатые области являются естественными границами геномных доменов, считалось, что домен имеет размер порядка т. Хеббса и соавт. Также в работе Хеббса было продемонстрировано, что область чувствительности хроматина к ДНКазе I совпадает с областью гиперацетилирования коровых гистонов . Кроме того, в состав домена входит эритроидспецифичный энхансер , который расположен между взрослым и эмбриональным генами i . Энхансер является общим для двух генов и содержит сайты связывания различных трансдействующих факторов, специфичных для каждой стадии развития. Конкуренция между этими регуляторными факторами и определяет предпочтительную мишень для действия энхансера . Энхансер может направлять экспрессию, зависящую от количества копий, репортерного гена у трансгенных мышей i . В 5некодирующей области домена идентифицировано четыре сайта гиперчувствительности к ДНКазе I i . В домене бета глоби новых генов три эритроидспецифичных гиперчувствительных сайта расположены относительно близко к генам. С 5стороны домен отделен от прилегающего хроматина четвертым сайтом гиперчувствитслыюстн, который содержит зависимый инсулятор и определяет границы домена i . Еще один участок гиперчувствительности к ДНказс I колокализустся с энхансером. В Зконцсвой области домена бетаглобиповых генов не обнаружено никаких регуляторных элементов. Зграница домена отмечена, повидимому, сайтом гиперчувствительности, расположенным на расстоянии 3 т. В этом участке гиперчувствительности к ДНКазе I располагается зависимый инсулятор. Любопытно, что этот инсулятор обладает способностью блокировать активность энхансеров, но не защищает трансгены от позиционных эффектов i . Таким образом, весь домен бетаглобииовых генов кур расположен между двумя инсуляторами. Перед доменом располагается область конденсированного хроматина, протяженность которой на молекуле ДНК составляет г.