Свойства неточной ДНК-полимеразы йота в экстрактах клеток эукариот

• Автор: Макарова, Алена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

1. Роль специализированных ДНКполимераз в поддержании постоянства генома, репарации и гипермутагенезе

1.1. Общая характеристика специализированных ДНКполимераз

1.2. Специализированные ДНКполимеразы как защитники генома живых организмов

1.3. Вовлечение специализированных ДНКполимераз в гипермутагенез ДНК

1.4. Роль специализированных ДНКполимераз в развитии онкологических заболеваний

1.5. Регуляция активности специализированных ДНКполимераз в клетке

2. Необычные свойства и возможные функции ДНКполимеразы йота i млекопитающих

2.1. Биохимические свойства i i vi

2.2. Строение активного центра человека

2.3. Регуляция активности i в клетке и организме

2.4. Поиск функций i в организме млекопитающих Ш. Материалы и методы

1. Список использованных ферментов, растворов и сред
2. Животные
3. Бактериальные штаммы
4. Синтетические олигонуклеотиды
5. Плазмидные векторы
6. Базовые методы молекулярного клонирования
6.1. Трансформация клеток . i
6.2. Обработка ДНК рестрикгазами
6.3. Лигирование
6.4. Препаративный электрофорез ДНК и выделение фрагментов для клонирования из геля
6.5. Сайтнаправленный мутагенез
6.6. Анализ рекомбинантных и мутантных клонов
7. Методы продукции рекомбинантных белков млекопитающих в vii
7.1. Экспрессионные вектора
7.2. Трансформация клеток . vii
7.3. Продукция рекомбинантной i в . vii
8. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
8.1. Выделение нуклеиновых кислот
8.2. Электрофорез нуклеиновых кислот
8.3. Полимеразная цепная реакция ПЦР и обратная транскрипцияполимеразная цепная реакция ОТПЦР
9. Методы работы с белками
9.1. Фракционирование и очистка белков
9.2. Иммуноблоттинг
. Тестирование активности
.1. Принцип тестирования дГТФТ активности в экстракгах клеток эукариот .
.2. Приготовление экстрактов клеток дрожжей
.3. Приготовление экстрактов клеток тканей и органов животных
.4. ДНКполимеразная реакция с меченным олигонуклеотидным субстратом
. Анализ нуклеотидных последовательностей
.1. Поиск последовательностей в базах данных
.2. Построение филогенетического древа
. Методы статистической обработки результатов исследований
IV. Результаты и их обсуждение
1. дГТФТ активность в экстрактах клеток сегечтае, продуцирующих склонную к ошибкам Ро человека
2. Анализ дГТФТ активности I в организме позвоночных животных
2.1. Анализ дГТФТ активности I в органах домовой
3. Изучение свойств i человека с делениями и заменами аминокислот, представляющих эволюционно и транскрипционнополиморфные формы фермента
3.1. Оценка ДНКполимеразной активности экстрактов клеток
. vii, продуцирующих мутантные формы i человека
3.2. Оценка ДНКполимеразной активности очищенных ферментных препаратов мутантных форм i человека
V. Выводы
VI. Список литературы
2.2. Филогенетический анализ I
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АП сайты апуриновые и апиримидиновые сайты БСА бычий сыворотный альбумин ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота дАТФ дезоксиаденозинтрифосфат дГТФ дезоксигуанозинтрифосфат
дГТФТ активность по включению дезоксигуанозинтрифосфата
напротив матричного тимина ДНК
дНТФ дезоксинуклеозидтрифосфат
дРФ лиаза дезоксирибофосфат лиаза
дТТФ дезокситимидинтрифосфат
дЦТФ дезоксицитидинтрифосфат
ККЦ контроль клеточного цикла
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
ПЦР полимеразная цепная реакция
РМС репарация межнитевых спшвок ДНК
СГМ соматический гипермутагенез СПУ синтез в поврежденных участках ДНК тРНК транспортная рибонуклеиновая кислота ЭРН эксцизионная репарация нуклеотидов ЭРО эксцизионная репарация оснований А аденин Г гуанин Т тимин У урацил Ц цитозин
а.о. аминокислотные остатки п.н. пар нуклеотидов
уГОПдГ угидрокси1 ,Ы2пропанодезоксигуанозин
ВВЕДЕНИЕ


Цель настоящей работы заключалась в изучении активности склонной к ошибкам i в экстрактах клеток эукариот. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведено исследование склонной к ошибкам i с применением методики тестирования активности ДНКполимеразы непосредственно в экстрактах клеток эукариот. Впервые охарактеризована активность i в организме М. В работе показано отсутствие активности i у мышей линии 9, несущих нонсенс мутацию во втором экзоне гена I. Установлено, что в организме мышей линии 9 мРНК i претерпевает альтернативный сплайсинг по второму экзону с сохранением рамки считывания, однако образующийся в ходе трансляции укороченный фермент не обладает ДНКполимеразной активностью. Работа представляет собой первое филогенетическое исследование i позвоночных животных. Установлена связь между появлением дГТФТ активности 1 у млекопитающих с заменой II активного центра фермента. В работе впервые получены и описаны свойства ряда мутантных форм 1 человека, несущих замены эволюционно полиморфных и консервативных аминокислот, а также делецию второго экзона ДНКполимеразы. Данные об активности 1 в организме домовой мыши и изменении биохимических свойств фермента в филогенезе важны для поиска биологической функции . Информация о биохимических свойствах мутантных форм 1 человека расширяет представление о структуре активного центра фермента и механизме катализа ДНКполимеразной реакции. Предложенная система экспресстестирования активности 1 в экстрактах клеток . ДНКполимераз. Методика тестирования активности 1 в эксграктах клеток животных представляет практический интерес для изучения активности i в организме человека в норме и при различных патологиях, в частности при изучении и комплексной диагностике злокачественных новообразований. Тестирование дГТФТ активности 1 в опухолях глаза апробируется у пациентов Офтальмологической клинической больницы Департамента здравоохранения г. Москвы. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 материалы симпозиумов и конференций. ДНК и эпигенетической регуляции стабильности генома СанктПетербург, Россия, , конференции Американского общества микробиологии Мутагенез и репарация ДНК от молекулярной структуры к болезни человека Вистлер. Канада, , IV Российском симпозиуме Белки и пептиды Казань, Россия, . Диссертационная работа была апробирована на совместных семинарах Сектора развития методов молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН и Лаборатории биохимии Института биологии развития РАН Москва, , семинарах Медицинского центра Университета Небраски Омаха, США, и и семинарах Института молекулярной генетики РАН. Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 9 страницах машинописного текста, содержат рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 4 источника. Воспроизведение и передача генетической информации осуществляются в ходе репликации высокоточными репликативными ДНКполимеразами, частота ошибок которых на неповрежденной матрице составляет . Но ДНК живых организмов подвергается повреждениям, возникающим под действием разнообразных химических и физических факторов. Спонтанно в каждой клетке млекопитающих образуется около 0 повреждений в день i Т. В процессе эволюции у живых организмов выработался сложный механизм удаления повреждений и восстановления первичной структуры ДНК репарация. Известно несколько типов репарационных процессов эксцизионная репарация оснований ЭРО, эксцизионная репарация нуклеотидов ЭРН, мисмагчрепарация и др. Однако репарационные системы не всегда успевают ликвидировать повреждения до начала очередного раунда репликации. Изза требований к пространственной структуре каталитического центра в природе не существует ДНКполимераз, которые могли бы сочетать в себе возможность осуществлять высокоточный синтез неповрежденной ДНК и способность продолжать эффективный и корректный синтез в поврежденных участках.