Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1

• Автор: Плешкан, Виктор Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Цели и задачи работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Метилирование и другие эпигенетические факторы, влияющие на экспрессию генов

1.1.1 Г ИСТОМЫ И МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК

1.1.2 Петли хроматина и метилирование ДНК

1.1.3 Метилирование при импринтинге

1.1.4 Регуляторные белки и i

1.1.5 Тканеспецифичность транскрипции генов обусловленная метилированием.

1.2 Изменения уровня метилирования при различных патологиях.

1.2.1 Гипометилирование ДНК

1.2.1.1 Активация онкогенов
1.2.1.2 Метилирование мобильных элементов
1.2.1.3 Хромосомная нсегабилыюсть
1.2.3 Метилирование ДНК и горячие точки мутаций
1.3 Особенности транскрипции генов с промоторов не содержащих канонических ТАТАпоследовательностей
1.3.1 Основные свойства инициаторного элемента I.
1.3.2 элемент промотора
1.3.3 Проксимальный и дистальный промоторые элементы.
1.3.4 МТБ элемент i
1.3.5 элемент
1.3.6 Элементы, специфические для содержащих последовательность промоторов
1.3.7 островки.
1.3.8 Частные случаи регуляции генов не содержащих ТАТАпоследовательпость.
1.3.8.1 Регуляция транскрипции генов 1 семейства.
1.3.8.1.1 Структура промотора гена и тканеспецифичность экспрессии
1.3.8.1.2 Особенности гена
1.3.8.2 Регуляция транскрипции гена
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 Определение тканеспецифичности транскрипции генов 1 и 1
2.1.1 Транскрипция в клеточных линиях.
2.1.2 Транскрипция в эмбриональном легком человека
2.1.3 Транскрипция в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода
2.1.4 Исследование тканеспецифичности транскрипции в 5областях генов 1 и 1.
2.1.4.1 5 гена
2.1.4.2 Транскрипция изоформ гена 1, отличающихся но содержанию экзона 4.
2.1.4.3 Тканеспецифичность экспрессии транскриптов, инициированных с промоторов Р1 и Р
2.2 Определение статуса метилирования участков генов 1 и 1
2.2.1 Использование деметилирующего агента 5Аза
2.2.2 Бисульфитное секвенирование промоторов Р1 и Р2 гена 1.
2.2.2.1 Метилирование промотора Р
2.2.2.2 Метилирование промотора Р
2.4.2.3 Характер метилирования промоторов Р1 и Р2.
2.2.3 Анализ метилирования промотора Р2 мегилспецифическим Г1ЦР.
2.2.4 Метилирование и транскрипция
2.2.5 Определение метилирования в протяженных участках генов 1 и 1.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Материалы.
3.1.1 Ферменты и реактивы.
3.1.2 Оборудование
3.1.3 Расходные материалы.
3.1.4 Буферные и другие растворы
3.1.5 Микробиологические среды
3.1.6 Клеточные линии.
3.1.7 Праймеры, последовательность нуклеотидов
3.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.2.1 Выделение РНК и геномной ДНК
3.2.1.1 Выделение РНК.
3.2.1.2 Определение концентрации II.
3.2.1.3 Анализ выделенной РНК методом гель электрофореза
3.2.1.4 Выделение геномной ДНК
3.2.1.5 Высаживание.
3.2.2 Обработка ДНКазой.
3.2.3 Синтез первой цепи кДНК.
3.2.3.1 Построение первых цепей кДНК для ОТПЦР.
3.2.3.2 Контроль на наличие примесей ДНК, ОТ контроль
3.2.3.3 Построение первых цепей кДНК для
3.2.4 ПЦР.
3.2.4.1 ОТПЦР
3.2.4.2 Геномная ПЦР
3.2.4.3 Электрофорез
3.2.5 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДИК и ПЦР фрагментов.
3.2.6 Нуклеотидные последовательности и их анализ.
3.2.7 Бисульфитное секвенирование.
3.2.7.1 Секвенирование богатых областей генов 1 и
3.2.7.2 Секвенирование промоторного участка гена
3.2.8 Молекулярное клонирование.
3.2.8.1 Лигирование.
3.2.8.2 Клонирование
3.2.8.3 Трансформация.
3.2.8.4 Выращивание ночной культуры клеток
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


С другой стороны, изучение основ регуляции генов, и, в особенности, маркерных, может иметь важное значение для терапии опухоли. Одной из характеристик определяющих функциональный статус гена является метилирование. Метилирование ДНК вносит свой вклад в механизмы контроля экспрессии генов и играет важнейшую роль в клеточной физиологии. Вс больше данных говорит в пользу того, что определнный характер метилирования генома важен для нормального функционирования клеток и целых органов. Определенный характер метилирования ДНК устанавливается во время эмбрионального развития организма, и его изменения могут привести в дальнейшем к нарушениям развития, преждевременному старению, прогрессии опухолевых заболеваний, подавлению экспрессии онкосупрессоров гены, подавляющие развитие опухолей. На данный момент накоплено много данных об аберрантном метилировании в различных опухолях, о его корреляции с уровнем экспрессии, стадией развития и происхождением опухоли. Подобное влияние метилирования вероятно проистекает из того, что при его помощи происходит регуляция транскрипции генов. Считается, что метилирование регуляторных элементов генов, таких как промотор, энхансер и инсулятор обычно приводит к супрессии функции гена. Метилирование района нитрона наоборот, может обеспечить активность гена, поскольку в этом случае, метилирование нитрона может препятствовать взаимодействию с белкамирепрессорамн. Неактивное состояние гена так же может быть обусловлено особой компактной структурой хроматина гетерохроматина, которая образуется в результате взаимодействия ДНК со специфическими хромосомными белками. ДНК и, напротив, деметилирование ДНК может сопровождаться активацией гена. Обычно уровень метилирования генов сохраняется в процессе развития организма. Однако в зависимости от множества факторов, он может меняться при его взрослении. Подобные изменения могут являться, как нормальным ответом клетки па действующие на нее внешние стимулы, так и происходить в результате неправильной работы какихлибо клеточных систем. Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ дифференциальной транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. Механизмы, вовлеченные в регуляцию экспрессии генов, вполне могут быть вовлечены в процессы опухолевой прогрессии, и на современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит нс только выявить общие принципы регуляции генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия на структуры, способствующие развитию опухоли. По этой причине, экспрессируемые на поверхности клеток рецепторные белки, которые могут узнаваться цитотоксическимн Тлимфоцитами иили моноклональными антителами, являются перспективным объекгом для диагностики и для специфически направленной иммунотерапии и иммуномодуляции опухолевых заболеваний. Рецептор 1, кодируемый геном . Оба типа клеток обладают цнтотоксичсской активностью и способны узнавать и уничтожать различные виды клеток, в том числе опухолевые, вирусинфицированные клетки и чужеродные трансплантанты. Биологическая функция рецептора 1 человека до сих пор остается неясной, предполагается, что он может участвовать как в регуляции цитотоксических функций клеток, так и в регуляции продукции цитокииов. Механизмы регуляции экспрессии 1 гена до сих пор не изучены. Основным конечным продуктом гена 1 является трансмембранный гликопротеин 3. Он является специфическим маркером гемопоэтических стволовых клеток ГСК и, с недавнего времени, используется при скрининге ГСК. Отобранные по маркеру 3 клетки обладают большим пролиферативным потенциалом, нежели при ранее использованных маркерах ГСК. Известно, что метастазы, являющиеся во многом причиной смертности от рака, зачастую обладают фенотипом стволовых клеток, и, в частности, несут на своей поверхности характерные маркеры. Иногда такие клетки называют раковыми стволовыми клетками, благодаря неограниченной способности к делению, устойчивости к апоптозу и лекарствам. Идентификация таких клеток очень важна при прогнозировании и лечении онкозаболеваний.