Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль в инвазии эукариотических клеток

• Автор: Божокина, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протеолитических ферментов

2. Протсолитичсскис ферменты микроорганизмов

2.1. Сери новые протеиназы

2.2. Цистеииовые протеиназы

2.3. Аспарагиновые протеиназы

2.4. Мегаллонротеиназы

2.5. Бактериальные внеклеточные цинксодержащие металлопротеазы

3. Механизмы регуляции протеолитических ферментов
3.1. Роль протеолитических ферментов в биологической регуляции
3.2. Механизмы активации зимогена
3.3. Цистсиновый свитч
3.4. Регуляция активности бактериальных протеиназ
3.5. Организация генов бактериальных протеиназ
3.6. Кон троль генетической экспрессии на уровне транскрипции и
трансляции
3.7. Посттрансляционныс модификации протеиназ
3.8. Внеклеточные бактериальные протеазы и из роль в патогенезе
3.9. Взаимодействие протеиназ с ингибиторами
3 Другие факторы, контролирующие активность протеиназ
4. Ораниченньй протеолиз
4.1. Офаниченный протеолиз как метод исследования структуры и
функции белков
4.2. Акгин и его протеолиз
4.3. Протеолиз актина бактериальной иротеазой ЕСР
5. Механизмы бактериальной инвазии
5.1. Инвазирующие бакгерии
5.2 Инвазирующие бактерии, проникающие в цитоплазму
5.3. Гснстичсскис основы инвазии бактерий . xi
5.4. Организация генов . xi на большой вирулентной плазмиде
5.5. Хромосомные гены бактерий, связанные с вирулентностью
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, использованные в работе, условия
культивирования
2. Клеточные линии и условия культивирования
3. Получение актина скелетных мышц кролика
4. Определение протеолитичсской активности
5. Клонирование гена гримелизина
6. Определение сайта расщепления актина
7. Заражение эукариотических клеток бактериями
8. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
9. Оценка количественной инвазии бактерий
. Саузернгибридизация ДНК
. Аффинная очистка белков
. Методы компьютерного анализа
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
1. Ограниченный протеолиз актина и инвазивный фенотип бактерий,
подвергшихся действию фуразолидона
1.1. Инвазивные свойства непатогенного мутанта i xi 5а2с,
полученного под действием фуразолидона
1.2. Анализ клинических изолятов 3, 7, и , полученных
от пациентов, длительно лечившихся фуразолидоном
2. Исследование распространения ЕСРподобной протеолитичсской
активности в различных бакгериях
2.1. Выявление ЕСРподобной активности в энтсробактериях
2.2. Количественная инвазия штаммов энтсробактерий,
обладающих и не обладающих ЕСРгримелизинподобным фенотипом
3. Клонирование гена протсазы и характеристика фермента
3.1. Идентификация штамма А2, продуцента протсазы ЕСР
3.2. Последовательность гена гримелизина из штаммовиродуцентов
i iii А2 и i iii 3
3.3. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью i6 на
3.4. Экспрессия рекомбинантного белка с последовательностью i6 на С
3.5. Исследование ограниченного протсолиза актина рекомбинантным
белком
3.6. Исследование ограниченного протсолиза актина рекомбинантным
белком
3.7. Определение сайта расщепления актина рекомбинантным
гримелизином
3.8. Очистка рекомбинантного 1римелизина на iсодержащих аффинных
носителях
3.9. Очистка рекомбинантного 1римелизина в денатурирующих условиях
3 Анализ ДНК энтеробакгерий
4. Анализ инвазии рекомбинантных штаммовпродуцентов гримелизина
4.1. Анализ инвазии по данным конфокальной микроскопии
4.2. Количественная инвазия рекомбинантных штаммов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Протеаза обладает высокой избирательностью к субстратам, очевидно являясь ферментом, чувствительным к их конформации, более того, протеаза гидролизует в актине лишь одну, не затрагиваемую другими протеазами, связь, которая играет особую роль в функционировании актиновой молекулы. Широкое распространение актина в живых клетках и большое разнообразие и важность выполняемых им функций вызывают огромный интерес исследователей к этому белку, и продукт ЕСРпротеолиза является уникальной моделью для исследования актина i vi и i viv. Таким образом, протеаза ЕСР важна и как объект, и как инструмент в исследованиях процессов в про и эукариотической клетке и механизмов взаимодействия бактерия эукариотическая клетка в патогенезе. Цель и задачи исследования. Выяснить, содержат ли непатогенные мутанты . xi 5а2с, полученные с помощью фуразолидона, известные вирулентные гены . xi, и сохраняют ли они способность к инвазии. Провести скрининг бактерий, выделенных из клинических изолятов, для выявления штаммов, способных к синтезу ЕСРподобных актинсиецифичсских протсаз. Клонировать и экспрессировать ген протеазы ЕСР. Исследовать свойства рекомбинантного фермента ЕСР. Исследовать инвазивную активность природных и рекомбинантных бакгерий, синтезирующих актинспецифичсскис протеазы. В референтном штамме i iii 3 обнаружена новая металлопрогсаза гримслизин, сходная по молекулярной массе, концевой последовательности, способности ограниченно расщеплять молекулу актина между Гли и Вал и чувствительности к действию хелаторов с протеазой ЕСР. Таким образом, ЕСР, повидимому, является 1римелизином. Клонирован и экспрессирован геи гримелизииа. Сравнение гримеяизина с металлопротеазой протсализином из i выявило различия по 8 аминокислотным остаткам, большинство из которых находится на концс молекулы фермента и, возможно, имеет функциональную значимость. Скрининг бактерий из клинических изолятов выявил бактериальные штаммы, способные к шраниченному иротеолизу актина, сходному с ограниченным протсолизом акгииа ЕСРгримелизином. Протеолиз актина термолизиноподобными металлопротеазами энтсробактсрий видов i, и может быть частью механизма инвазии этих бактериальных штаммов в эукариотические клетки. Научная новизна. Впервые установлено точное систематическое положение штамма бактерийпродуцентов протеазы ЕСР, специфически расщепляющей актин. Показано, что по данным биохимических реакций и последовательности бактерии, определенные ранее как i i Л2, идентичны энтеробактериям i iii А2. В референтном штамме i iii 3 впервые выявлена и охарактеризована протсаза гримелизин. Ген гримелизина клонирован и экспрессирован в штамме . К. Показано, что фермент является нейтральной термолизиноподобной металлопротеиназой семейства М4. Показано, что гримелизин и ЕСР это один и тог же белок. Впервые выявлена ЕСРгримелизиноподобная актиназная активность в широком спектре бактериальных штаммов. Впервые показано, что бактерии . способны к инвазии в эукариотические клетки. Впервые установлена корреляция между протеолитической активностью рекомбинантных штаммов, продуцентов ЕСРгримслизина и их инвазией в эукариотические клетки. Теоретическое и практическое значение работы. Рекомбинантный гримелизин может быть использован для ораниченного протсолиза актина с целью изучения его свойств и процесса полимеризации, лежащего в основе функционирования акгина в клетке, а также при исследовании внутриклеточных функций акгина. Кроме того, возможно использование рекомбинантного гримелизина при изучении структуры и функций других белков. Рекомбинантные бактериипродуценты могут быть использованы для изучения инвазии бактерий в эукариотические клетки, а также для изучения функциональных особенностей клетки. Поскольку высокой чувствительностью к инвазии обладают только трансформированные клетки, инвазия рекомбинантных бактерий, экспрессирующих гримелизин, может использоваться в качестве физиологического теста при изучении факторов, связанных с трансформацией клеток, и фармакологических агентов, влияющих на трансформацию.