Экспериментальные подходы к идентификации и картированию ЦИС-регуляторных элементов в протяженных областях генома человека

• Автор: Николаев, Лев Григорьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 191 с. : ил.

Ядерный матрикс состоит в основном из белков, но содержит также небольшие количества ДНК см. РНК и других компонентов . Появилось предположение, что именно ядерный матрикс является тем структурным компонентом интерфазного ядра, который организует фибриллу хроматина диаметром нм в петельные домены. Первый метод основан на обработке изолированных клеточных ядер ДНКазой I, с последующим удалением основной массы внутриядерных белков и ДНК с помощью промывки буфером, содержащим 2 М . Альтернативный метод получения ядерного матрикса названного авторами метода яденым скэффолдом основан на действии 3,5дийодсалицилата лития ivi . В этом случае удаление основной массы ядерных белков осуществляется более мягко, путем промывок изолированных клеточных ядер низкосолевым буфером, содержащим 1, а для удаления ДНК из дегистонизированных ядер применяют рсстриктазы. По данным электронной микроскопии, для ядерного матрикса характерно наличие трех структурных компонентов остаточной ядерной ламины i с норовыми комплексами, остаточного ядрышка и фибриллярногранулярной структуры, заполняющей пространство внутри ядра и называемой внутренним матриксом . Позднее был предложен еще один подход к идентификации в условиях, близких к физиологическим, структур, из которых происходит ядерный матрикс . Метод основан на электрофоретическом удалении основной массы компонентов ядра из клеток, помещенных в 0,5 агарозу. Лизис инкапсулированных клеток проводят в условиях, близких к физиологическим, клеточный лизат, иммобилизованный в агарозном геле, обрабатывают ДНКазой I или рсстрик газами, после чего подвергают его электрофорезу. Относительно низкомолскулярныс компоненты белки, фрагменты хроматина свободно проходят через слой агарозы, а остаточные ядра и другие крупные клеточные структуры остаются фиксированными в толще геля. Ультраструктура полученных таким образом остаточных ядер близка к структуре ядерного матрикса из изолированных ядер. В метафазной хромосоме структурой, аналогичной по составу и возможным функциям интерфазному ядерному матриксу скэффолду, является мстафазный скэффолд ivi . ДНК в составе ядериого матрикса и ее свойства. В составе ядерного матрикса остаются фрагменты ДНК, прочно связанные с белковым скелетом и устойчивые к действию высоких концентраций солей и нуклеаз. Содержание прочно связанной ДНК в составе ядерного матрикса может варьировать в зависимости от метода его получения. При длительном воздействии нуклеаз в совокупности с жесткой обработкой изолированных ядер, в ядерном матриксе сохраняется небольшое количество прочно связанной ДИК ямДНК . Имеются данные, что ямДНК входит в состав ядерного матрикса в виде моно и олигонуклеосом v . Появление петельнодоменной гипотезы строения интерфазного хроматина i вызвало интерес к изучению ямДНК как фракции, содержащей потенциальные участки прикрепления оснований петельных доменов к ядерному матриксу. Были предприняты попытки клонирования и анализа этой ДНК непосредственно из ядерного матрикса, полученного либо методом солевой экстракции i , либо при помощи I ii . Основной недостаток этого подхода заключается в том, что в процессе выделения ядерного матрикса возможно перераспределение и захват ядерным матриксом тех фрагментов ДНК, которые не входили в его состав i viv. При дальнейшем анализе такие фрагменты нельзя отличить от настоящей ямДНК. Подход, использующий инкапсуляцию клеток в легкоплавкой агарозе см. Предполагаемые участки прикрепления петельных доменов, идентифицированные этим методом, были названы участками прикреплении петель , i . Метод, однако, не получил широкого распространения, повидимому, ввиду сложности и невысокой воспроизводимости. Значительно более распространенным стал другой метод идентификации последовательностей ДНК, предположительно ответственных за прикрепление оснований петельных доменов хроматина к ядерному матриксу. Метод основан на специфическом связывании некоторой фракции экзогенных фрагментов ДНК с выделенным ядерным матриксом скэффолдом i vi в присутствии большого избытка прокариотической ДНК.