Характеристика пространственной организации домена α-глобиновых генов кур

• Автор: Гаврилов, Алексей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список СОКРАЩЕНИЙ

Введение.

I. Обзор литературы

1.1. Структурнофункциональная организация генома в клеточном ядре.

1.1.1. Ядерные белковые тельца.

1.1.2. Хроматиновые домены.

1.1.3. Транскрипционные фабрики

1.1.4. Организация хромосом в интерфазном ядре.

1.1.5. Локализация генов внутри хромосомных территорий.

1.1.6. Модификации хроматина.

1.1.7. Подвижность и перемещение генетических локусов
1.1.8. Ассоциация генов с ядерной периферией и ядерными порами.
1.1.9. Изменение внутриядерной локализации генов в течение клеточной дифференцировки.
1.1 Межхромосомные взаимодействия
1.11. Гомологичные межхромосомные взаимодействия.
1.12. Негомологичные межхромосомные взаимодействия.
1.2. Регуляция экспрессии генов с помощью
1.2.1. как сложный энхансср
1.2.2. и открывание хроматина.
1.2.2.1. Домен Рглобиновых генов
1.2.2.2. Домен гена гормона роста
1.2.3. и петли хроматина
1.2.3.1. Домен iглобиновых генов.
1.2.3.2. Л оку с ТИ2.
1.2.4. и межгенная транскрипция.
1.2.5. Границы геномных доменов.
1.2.6. Другие функции .
III. Структу рнофункциональная организация домена аглобишшых генов кур. .
1.3.1. Функциональные элементы домена.
1.3.2. Структу рные элементы домена.
1.3.3. Межгенная транскрипция.
II. Материалы и методы.
.1. Работа с куриными клетками
II. 1.1. Ведение клеточных культур
II. 1.2. Индукция дифференцировки клеток II3 по эритроидному пути.
II. 1.3. Определение количества мертвых клеток
II. 1.4. Выявление гемоглобина в клетках
II. 1.5. Выделение эмбриональных эритроцитов
.2. Работа с ДИК и РНК
.2.1. Выделение геномной ДНК из культивируемых клеток.
.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
.2.3. Выделение тотальной РНК из культивируемых клеток
.2.4. Электрофорез РНК в агарозном геле.
.2.5. Полимеразная цепная реакция.
П.2.6. Приготовление радиоактивных ДНКзондов для нозернблотгибридизации .
Н.2.7. Нозернблотгибридизация РНК
.2.8. Выделение бакмидной ДНК из клеток Е.соП.
.2.9. Спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот.
.3. ЗСанализ
.3.1. Фиксация клеток и изоляция ядер.
Н.3.2. Рестрикция и лигирование ДНК.
.3.3. Очистка продуктов лигирования.
П.3.4. ПЦР в реальном времени с ТаяМаппробами
II.3.5. Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования
.4. Прш рамное обеспечение.
III. Результаты исследований.
Ш.1. Клеточная модель для сравнительного ЗСанализа домена аглобиновых
генов кур
Ш.2. Количественный ЗСанализ домена аглобиновых генов кур принцип
метода и контрольные эксперименты
Ш.2.1. Основы метода ЗС.
Ш.2.2. Подбор реегриктаз, праймеров и ТацМаппроб.
Ш.2.3. Количественный ПЦРанализ продуктов лигирования
Ш.2.4. Контроль специфичности Г1ЦРамнлификации.
Ш.2.5. Оценка эффективности рестрикции
Ш.2.6. Контроль качества и количества ДНК в ЗСобразцах.
Ш.2.7. Отрицательные контроли.
. Сравнение пространственной организации домена аглобиновых генов в нсэритроидных клетках кур и трансформированных эритроидных клетках кур до и после начала транскрипции глобиновых генов
Ш.4. Анализ пространственной организации домена аглобиновых генов в нормальных эмбриональных эритроцитах кур
IV. Обсуждение результатов.
Выводы.
Список ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Предметом изучения стала и позиция домена рглобиновых генов в ядерном пространстве на разных стадиях развития эритроидных клеток . Рглобиновых генов . примере этих же доменов были изучены свойства инсуляторов особого класса генетических элементов, характеризующихся способностью препятствовать гетерохроматизации и блокировать активирующее воздействие энхансера на промотор при нахождении на цепи ДНК между энхансером и промотором . i . V . Еще одна группа исследований, ведущихся вот уже более лег с момента обнаружения гиганских транскриптов домена аглобиновых генов кур ЗсЬеггег е а1. Й транскрипции влЬпаи е а1, Кяат е1 а1. Наконец, домены а и рглобиновых доменов явились моделями для изучения механизмов контроля времени репликации ДНК у эукариот топ е а. Итак, локусы а и Рглобиновых генов представляют одни из наиболее изученных областей генома у высших эукариот. Однако с решением одних исследовательских задач неуклонно возникают новые вопросы. Так, до сих пор не установлены точные механизмы переключения транскрипции глобиновых генов с эмбрионального на взрослый тип, не раскрыты принципы работы сайленсеров и инсуляторов домена и не дано однозначного ответа относительно их функции, не выяснено, как в действительности функционирует ЬСЯ. В домене аглобиновых генов кур за многие годы его исследований были найдены и охарактеризованы группы позитивных и негативных регуляторных элементов, подробно изучена структура транскрипционных единиц, однако до сих пор четкой картины регуляции транкрипции в домене не получено. Целыо настоящей работы явилось изучение механизмов активации транскрипции аглобиновьгх генов у курицы. Для раскрытия этих механизмов мы решили выяснить, происходит ли пространственное взаимодействие какихлибо регуляторных элементов домена между собой и с промоторами аглобиновых генов в условиях, когда домен неактивен, и изменяется ли пространственная конфигурация домена при активации транскрипции глобиновых генов. Отработать систему искусственной дифференцировки культивируемых куриных прсэритробластов в эритроциты. Используя полученную систему, с помощью метода фиксации конформации хромосомы ЗС изучить пространственную организацию домена аглобиновых генов в клетках до и после активации транскрипции глобиновых генов. Сравнить пространственную организацию домена аглобиновых генов в культивируемых эритроидных клетках с таковой в нормальных куриных эритроцитах и клетках неэритроидного происхождения. Одной из характерных особенностей ядра эукариотической клетки орган еллы, в которой хранится и считывается генетическая информация, является чрезвычайная сложность его структурной и функциональной организации. Человеческий геном, насчитывающий около тысяч генов и 3. ДНК, компактизован по длине в 0 тысяч раз, что необходимо для размещения в сравнительно небольшом объеме клеточного ядра мкм . Упаковка ДНК в форме хроматина представляет высоко эффективный способ хранения генетической информации. Однако ДНК должна быть доступна для осуществления таких процессов как транскрипция, репликация, репарация и рекомбинация. Доступна ДНК или нет, контролируется клеткой, так как не все области генома активны на разных стадиях клеточного цикла. В настоящее время накапливается все больше экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что i и действующие регуляторные последовательности ДНК являются не единственными детерминантами в генетических процессах. Экспрессия генов зависит также от позиции генов в геноме, внутриядерной локализации последовательностей ДНК и сложного взаимодействия генома с различными ядерными структурами i , . Клеточное ядро подразделено на специфические компартменты, включающие ядерные белковые тельца, области эухроматина и гстерохроматина, области скопления специфических мультибелковых комплексов, ядерные поры, обеспечивающие траенпорт молекул из ядра в цитоплазму и обратно, и другие компартменты.