Биологическая активность эндогенных фрагментов гемоглобина в культурах нормальных и трансформированных клеток

• Автор: Калинина, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ВВЕДЕНИЕ.

КУЛЬТУРА ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК, КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ.

ИНДУЦИРОВАННАЯ ГИБЕЛЬ И ИЗМЕНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ

КЛЕТОК МННММННМНМННИНМИИИМННИИИИМИНММНМННИНМИНИМ

ПОНЯТИЕ ЦИТОЛИТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА.

Механизмы клеточной гибели.

Цитолитические процессы

Понятие пролиферативного процесса
Рефляция пролиферативных процессов в многоклеточном организме
Механизмы рецепторной передачи сигнала.
Белки, регулирующие пролиферацию.
Факторы роста
Цигокины.
Гены, регулирующие пролиферативные и цитолитические процессы.
ДЕЙСТВИЕ КЛАССИЧЕСКИХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ НА ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ
КЛЕТКИ .
ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ
БОМБЕЗИН И БОМБЕЗИНПОДОБНЫЕ ПЕПТИДЫ
СОМАТОСТАТИН И ЕГО АНАЛОГИ.
ВЛЗОАКТИВНЫЙ ИНТЕСТИНАЛЬНЫЙ 1КГПТД И ЕГО АНАЛОГИ.
Лиганды гастринхолецистокининовых рецепторов
НЕЙРОТЕНЗИН И ЕГО АНАЛОГИ
Вещество Р.
КАЛЬЦИТОНИН
Лютеюизи высвобождающий гормон и его аналоги.
ГОНАДОТРОПИНВЫСВОБОЖДАЮЩИЙ гормон .
Ваэопрессин
Заключение.
ФРАГМЕНТЫ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ
Происхождение фрагментов функциональных белков.
Фрагменты протеолитической деградации функциональных белков, выделенные из экстрактов тканей
животных.
Фрагменты функциональных белков, секретируемые кстками i vi.
Фрагменты, образующееся в результате протеолитической обработки различных белков и тканей i
Синтетические фрагменты функциональных белков
Биологическая активюсть фрагментов функциональных белков
Механизмы действия фрагментов функциоальньх белков
Рецепторные мишени фрагментов протеолитической деградации фупкционапыых белков
Действие фрагментов функциональных белков на ионные каналы.
Действие фрагментов функциональных белков на систему внутриклеточной передачи сигнала
ДЕЙСТВИЕ ФРАГМЕНТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ
БЕЛКОВ НА КУЛЬТУРЫ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ И НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Эффекты фрагментов протеолитической деградации фунюшональных белков на культурах
НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК.
Эффекты фрагментов протеолитической деградации функциональных белков на культурах
ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК.
Заключение
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .
ПРОТЕОЛИЗ ГЕМОГЛОБИНА I VIV
Внутриэритроцшпарный протсолиз гемоглобина
Фрагменты гемоглобина, секретируемые эритроцитами.
Протсолиз гемоглобина в тканях
Заключение
ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФРАГМЕНТОВ ГЕМОГЛОБИНА, ПРИСУТСТВУЮЩИХ В РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЯХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Биологическая активность В1Гутриэритюцитарных пептидов
Биологическая активность фрагментов гемоглобина, экскгетигуемых эритроцитами
Биологическая активюсть фрагментов гемоглобшга. представлеги 1ых в экстрактах i шй
МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
Заключение
ЭФФЕКТЫ ПЕПТИДОВ СТИМУЛИРУЮЩИХ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК.
Стимуляция пролиферации i юформирова и гых клеток в присутствии факторов роста
Восстановление пролиферации клеток костного мозга после обрлбочхи цитосгатическим препаратом
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ПЕПТИДОВ СЕМЕЙСТВА ГЕМОРФИНОВ
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕМОРФИНОВ В КУЛЬТУРЕ ТРА1 СФОРМИРОВАЛ 1ЫХ КЛЕТОК
Изучение цитолишческого и ,м ггипролиферативг ii о действия УУгеморфина5 методом проточной
цитофлюорпметрии
Сравнение противоопухолевой активности УУгеморфина5. с эффектами селективных лигаццов
опиатных рецепторов.
Изучение пролонгированного онколитического действия УУгеморфина
Изучение суммарной онколитической активности i при неоднократном добавлении
ПРЕП,РАТА
ПЮТИВОО 1УХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ УУГЕМ0РФИНА5 В ПАНЕЛИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК.
Биологическая активность геморфинов в первичной кулмуре нормальных клеток.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ нитмимммми1ммимимтмммнмимамиммм1ммимнмимммитнммимпмммт
Используемые линии клеток.
Культивиювание клеток.
ИССЛЕДУЕМЫЕ ВЕЩЕСТВА
Общая характеристика исследуемых веществ
Концентрации исагедуемых веществ.
Приготовление раствора исследуемого вещества.
Растворы исследуемых негггндов фрапгаггы гемоглобина,МсГзикефалини фактор некроиопухолей 0 Раствор эшфубшоша и иефсггокси1а П т яла кобры i xi.
Определение цитолитичкской активности
Определение цитолитической активности в отношении клеток линии К2.
Определение цитолитической активности в культуре трансюрмированных клеток 9.
Определение изменения количества клеток
Определение изменения количества клеток визхальио под микроскопом.
Определение количества клеток при окрашивании А ПТ.
Определение количества клеток при окрашивании сулыюродамином Б.
Клоногенный тест
Определение активности фрагментов гемоглобина в куль турах нормальных клеток.
Выделение клеток селезенки и костного мозга мыши
Определение активности фрагментов гемоглобина в переливающей кулыпуре клеток костного мозга
Определение активности фрагментов гемоглобина в переживающей культуре клеток костного мозга
Определение активности фрагментов гемоглобина в переживающей культуре спленоцитов мыши.
Определение фрагментации ДНК.
Определение количества клеток и анализ ДНК с помощью I 1юточного флуориметра.
Определение количества клеток.
Определение содержания ДНК
Статистическая обработка результатов.
ВЫВОДЫ мцмнимтжнимимнммнимммимиммммитми1тииимитМИИ4ИИИНИН
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Такой метод позволяет адекватно оценить процессы цитолиза, индуцируемые различными веществами. Для определения влияния исследуемых веществ на пролиферацию как правило используются методы, основанные на определении либо общего белкового материала, либо ферментативной активности живых клеток. К таким методам можно отнести окрашивание МТТ, генцианвиолетом, сульфорадомином Б и т. Эти методы не позволяют оценить вклад цитотоксичности, но дают возможность детектировать интегральные изменения количества клеток. Важность этих параметров напрямую связана с тем, что многие эндогенные пептиды, в отличие от ксенобиотиков, обладают способностью обратимо ингибировать пролиферацию и индуцировать резистентность к последующим добавлениям вещества. Наряду с этим, существуют подходы, позволяющие напрямую оценить как общее живые погибшие количество клеток, так и количество живых клеток, т. Это прямой подсчет клеток с использованием флуоцитометра, гемоцитометра, или в камере Горяева под микроскопом в присугствии красителя Трипанового синего . Они высоко коррелируют между собой по причине идентичности принципа анализа, наиболее подходят в случае первичной детекции активности пептидов и часто используются при изучении данного класса соединений. Очевидно, в случае скрининга, применимы наиболее дешевые методы, в частности, определение количества клеток под микроскопом. На основании вышеизложенного, для первичного скрининга пептидов из экстрактов тканей использовалось определение количества живых и погибших, т. Трипановым синим, клегок под микроскопом в камере Горяева. Этот же метод применялся для подбора экспериментальных условий при последующем изучении активных веществ в культурах клегок с использованием менее трудоемких и автоматизированных подходов окрашиванием МТТ и сульфородамином Б. Для наиболее полного описания предлагаемой тестсистемы по изучению биологической активности веществ, необходимо ввести понятие цитолитического и пролиферативного процесса и закономерностей их развития в культурах трансформированных клеток. В процессе развития и дальнейшего функционирования организма высших животных происходит как образование новых клегок, с последующей дифференцировкой, так и гибель уже закончивших свои жизненный цикл или неспособных к нормальному функционированию клеток. Процессы цитолиза наиболее характерны для эмбрионального этапа развития, где в ходе дифференцировки и органообразования элиминируется большая часть клеток. В постнатальном периоде лизис клеток происходиг как в норме, так и при патологии . В норме лизируются в основном клетки не способные к нормальному функционированию, в частности, клетки иммунной системы не прошедшие дифференцировку . При патологиях различной природы также происходит гибель клеток, прямо или опосредованно связанная как с заицггными функциями организма лизис опухолевых клеток, клеток, пораженных вирусами, спонтанный лизис при остром воспалении и т. В последнем случае такие процессы приводят к радикальному нарушению функционирования ткани как, например, при болезни Альцгеймера. Начало и дальнейшее развитие эндогенного цитолитического процесса, в отличие от искусственных моделей клегочной гибели, связанных с непосредственным повреждением мембраны осмотический шок, воздействие детергеггов или необратимым ингибированием ферментативных систем клетки цитостатики опосредованы специфическим воздействием сигнальных молекул. Ранее цитолитичекие свойства предполагались лишь для белков иммунной системы , , однако, на сегодняшний день установлено, что широкий спектр белков и пептидов, самого различного спектра действия обладают способностью специфически индуцировать гибель как нормальных, так и трансформированных клеток. Это дает возможность предполагать, наличие множества механизмов регуляции количества клеток в организме. В настоящее время выделяют два основных механизма специфической гибели клетки некроз и апоптоз . Апоптотический механизм гибели играет основную роль в процессе эмбриогенеза и является наиболее распространенным механизмом регуляции количества клеток в организме.