Повышение разрешающей способности и информативности хромосомного анализа растений

• Автор: Попов, Константин Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с.

1.1. История наблюдений хромосом до появления цитогенетики

1.2. Дифференциальное окрашивание хромосом.

1.3. Методы, основанные на гибридизации i i.

1.4. Методы повышения разрешения при исследовании хромосом

1.5. Методы анализа изображений для цитогенетического анализа

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Приготовление препаратов хромосом человека

2.2. Приготовление хромосомных препаратов прастений

2.2.1. Семенной материал

2.2.2. Проращивание семян

2.3. диффсренщюльное окрашивание препаратов хромосом человека

2.4. Сдиффсренциальное окрашивание препаратов хромосом растений
2.5. Окраска хромосом растений ацетоорсеином
2.6. Окрашивание препаратов флуоресцентными ДНК специфичными
красителями
2.7. Регистрация изображения хромосом
2.8. Освещение препарата светодиодами
2.9. Хромосомный анализ
2 Анализ изображения
. Оценка контрастности изображений хромосом, окрашенных красителем Гимзы
. Построение профиля яркости флуоресценции вдоль хромосом
. Сравнение скорости обесцвечивания флуоресцентных красителей
. Оценка содержания гетерохроматина в хромосомах нескольких сортов льна
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Отработка использования интеркаляторов ДНК этидия и 9аминоакридина для получения препаратов с хромосомами низкой степени конденсации
3.2. Исследование кариотипов модельных объектов с использованием 9аминоакридина
3.2.1 Сравнение рисунков С и подобных окрасок хромосом в кариотипах
трх сортов ромашки аптечной
3.2.2. Сравнение кариотипов родственных видов льна австрийского и льна крупноцветкового по рисункам Сокраски
3.2.3. Сравнение рисунков Сокрашенных хромосом трх образцов льна обыкновенного
3.2.4. Кариотнпическое сравнение трех близкородственных видов льна . iii . сорт льнадолгунца Оршанский 2 2п, лен узколистный i ii . 2п и лен двулетний i i i.
3.2.5. Кариотнпическое исследование ii iii .
3.3. Сравнение полиморфизма рисунков Сокраски четвргой хромосомы льна на препаратах, приготовленных с использованием 9амииоакридина, и четвртой хромосомы ячменя на препаратах, приготовленных по стандартной методике с использованием колхицина
3.4. Сравнение сортов льна культурного по площади гетерохроматических районов в ядрах и хромосомах
3.5. Сравнение качества изображений дифференциально окрашенных хромосом растений, полученных при освещении препарата лампой накаливания и светодиодами
3.6. Применение ДНКспецифичных димерных биебензимидазольных
флуорохромов для цитогенетических исследований человека и растений
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Получение подобного рисунка на хромосомах растений с помощью интеркаляторов ДНК
4.2. Измерение гетерохроматина
4.3. Применение светодиодов в микроскопии
4.4. Применение ДНКсиецифичных димерных биебензимидазольных
флуорохромов для цитогенетических исследований человека и растений
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
I 1ИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Решающий вклад в развитие этой области науки внесли работы, выполненные Торбьрном Касперсоном. В начале г. Касперсоном , , , Химическая дифференциация но длине метафазных хромосом i iii . Основная часть работы была проведена на хромосомах конских бобов Vii изза их крупных размеров. Было сделано заключение, что участки хромосомы могут быть различены дифференцированы по длине оси хромосомы, благодаря использованию антималярийного препарата акрихиниприта, обладающего свойствами люминесцентного красителя. В году выходят статьи , , , а , , , , в которых идея использования флуорохромов получила дальнейшее развитие. При длине волны 0 нм была измерена интенсивность свечения сильно флуоресцирующих участков бэндов, от английского слова полоска и сравнена с флуоресценцией остальных участков хромосом. Параллельно были получены диаграммы распределения ДНК по длине хромосом путем микроспектрофотометрии в ультрафиолетовой области 5 нм и при 6 нм для образцов, окрашенных по Фельгену. Измерения четко показали, что распределение ДНК поразительно однородно и стало ясно, что яркая флуоресценция сегментов не является следствием повышенного содержания в них ДНК. Почти сразу же за получением первых картин дифференциально флуоресцентно окрашенных хромосом Касисрсои с сотрудниками приступили к использованию разработанного метода для изучения хромосом человека , , , . Оказалось, что при воздействии акрихинипритом в метафазных хромосомах из культуры клеток крови проявляется четкая картина дифференциального окрашивания с отчетливо выраженными сегментами. Наиболее яркая, постоянная и воспроизводимая флуоресцентная картина была обнаружена в 3, и хромосомах. Как и на растительном материале, изученном ранее, образцы обладали характерными сегментами, которые могли помочь в идентификации хромосом. Очень скоро оказалось, что метод от англ. Так были изучены хромосомы В группы и обнаружено, что при синдроме кошачьего крика дистальная часть короткого плеча 5 хромосомы отсутствует , i, , . Было сделано заключение, что техника дифференциальной окраски помогает в локализации хромосомных разрывов и границ обменов при различного вида аберрациях , , i, . Для подтверждения этого предположения авторы исследовали 0 метафаз более 0 хромосом, полученных при рентгеновском облучении лимфоцитов человека , , ii, . Было обнаружено большое число аберраций транслокации, делеции, в то время как инверсии и дупликации были сравнительно редки. Авторы отметили, что разрешение флуоресцентного метода настолько велико, что возможно достаточно точно локализовать точку разрыва. Наибольшее число разрывов лежало в более бледных тусклых областях хромосомы, расположенных между сильно интенсивно светящимися сегментами. Рисунок флуоресценции хромосом был специфичен и воспроизводим, а в дальнейшем выяснилось, что и идентичен в разных тканях организма , , , . Параллельно проводилось изучение химической природы флуоресцентных сегментов. Здесь исследователи столкнулись со значительными трудностями. Как уже упоминалось, в своей первой работе Касперсон с сотрудниками предположили, что ярко флуоресцирующие бэнды, появляющиеся при обработке препаратов акрихинипритом, представляют собой участки ДНК, обогащенные ГЦ последовательностями. Это предположение, однако, не нашло подтверждения. С одной стороны оказалось, что акрихин, лишенный алкилирующен группы азотистого иприта, при повышенных в 0 раз концентрациях и других условиях обработки, чем использовались в первой работе, тоже дает четко выраженную картину дифференциальной исчерченности. Интенсивность флуоресценции на единицу площади хромосомы была, по крайней мерс, в пять раз ниже в образцах с акрихином, чем с акрихинипритом. Поэтому во флуоресцентном микроскопе сегменты при окраске акрихином всегда выглядели менее четко, чем в препаратах с акрихинипритом , , , а. Наконец, узкие полосы в хромосоме Vii , которые наблюдали в образцах с акрихинипритом, не удавалось выявить в препаратах с акрихином. Для Мхромосом эти регионы соответствовали гетерохроматиновым, выявленным с помощью методики Холодовой обработки.