Участки N-концевого домена фактора терминации трансляции эукариот eRF1, ответственные за узнавание стоп-сигналов в мРНК

• Автор: Колосов, Петр Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Терминация трансляции

1.1.1 Краткая схема трансляции. Участники терминационного события.

1.1.2 Участие рРНК рибосомы в терминации трансляции.

1.1.3 Факторы терминации трансляции 1 го класса.

1.1.4. Факторы терминации 2го класса

1.1.5 Взаимодействие и 3

1.1.6 Влияние контекста мРНК и пептидилтРНК на терминацию трансляции.

1.2 Функциональная анатомия человека
1.2.1 Мдомен человека. Минидомеи
1.2.2 домен 1 человека. Минидомен I I
1.2.3 домен человека. Минидомен xxxx
1.2.4 Сдомсн человека.
1.3 Гипотезы о декодировании стопкодонов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Материалы
2.1.1 Штаммы бактерий и плазмиды
2.1.2 Среды
2.1.3 Реактивы
2.1.4 Ферменты
2.1.5 Олигонуклеотиды
2.2 Методы исследований
2.2.1 Выделение плазмидной ДНК из .i
2.2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.3 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция лигирования ДНК
2.2.4 Трансформация . i плазмидной ДНК
2.2.5 Трансформация . i плазмидной ДНК методом электропорации
2.2.6 Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе
2.2.7 Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.2.8 Определение первичной структуры секвенирование
ДНК при помощи автомата ческой системы
i i I
2.2.9 Сайтнаправленный мутагенез с помощью праймеров, содержащих уникальный сайт рестрикции
2.2. Метод меглпраймерной Г со сменой матрицы
2.2.1 1 Амплификация концевых частей
гена 1 i i
2.2. Конструирование генов гибридных
2.2. Экспрессия и выделение белков
2.2. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ
2.2. Определение активности
2.2. Определение ГТФазной активности
2.2. мРНК аналоги
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕИЕ
3.1 Получение рекомбинантного белка 1 в . i
3.2 Получение с точечными заменами аминокислотных остатков в домене 1 человека.
3.3 Водородная связь между остатками Е и
3.3 Л. Замены аминокислот в области .
3.3.2. Замены аминокислот в положениях 4, 5 и
3.3.3. Водородная связь между остатками и Туг
3.4 Создание гибридной конструкции , где концевой
домен человека заменен на концевой домен инфузории vi ту i
3.5 Создание гибридных конструкций , в которых участки концевого домена 1 человека заменены участками концевого домена i ii
3.6 Сшивки мутантов человека по метионину со стопкодонами в рибосоме
3.7 Пуриновые основания стопкодонов в Лучастке рибосомы соседствуют с более протяженной областью концевого
домена 1, чем xxxx
3.8 Поведение индивидуальных доменов i vi
в ГТФазном тесте
3.9 Заключение
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Методом рентгеноструктурного анализа определена трехмерная структура фактора терминации 1го класса I человека . ЯМР определена трехмерная структура его Мдомена в растворе Ivv Е. Согласно данным структурного анализа фактор терминации состоит из трех доменов. концевой домен ответствен за узнавание стопкодонов, Мдомен вовлечен в процесс гидролиза ептидилтРГК в псптидилтрансферазном центре рибосомы, а Сконцевой домен взаимодействует с фактором терминации 2го класса, 3. Функции эукариотических факторов терминации обоих классов нуждаются в дальнейшем изучении. Так до сих пор не выявлены с достаточной степенью достоверности участки, вовлеченные в непосредственное узнавание стонсигналов мРНК, не изучен механизм гидролиза пептидилтРНК в пептпдплтраисферазиом центре рибосомы, недостаточно исследовано взаимодействие между факторами этих 2х классов. В настоящее время создан ряд предпосылок для таких исследований. Вопервых, для поиска функционально важных аминокислотных остатков стали широко использовать точечный мутагенез с последующим функциональным тестированием в системах i viv и i vi, вовторых, созданы базы данных для множества организмов с частично или полностью секвенировапным геномом, втретьих, обнаружено уже достаточно большое число организмов с так называемым вариантным генетическим кодом, использующих в качестве значащих кодонов один или два сгопкодона из трех существующих. Факторы терминации трансляции организмов с вариантным генетическим кодом, несмотря на высокую степень гомологии с большинством омнипотентпых факторов, проявляют биунипотентность при узнавании стопсигналов в мРНК, что дает возможность исследовать декодирующую функцию путем создания гибридных химерных форм факторов терминации трансляции. Основная цель работы состояла в выяснении функциональной роли аминокислотных остатков, находящихся в высококонсервативных участках молекулы , в особенности, поиск участков молекулы , вовлеченных в декодирование стопкодонов. Ранее, с использованием химерного подхода показано, что узнавание стопкодонов определяется доменом эуплоты v . . охарактеризовать взаимодействие доменов друг с другом, участие в образовании комплексов , их влияние на способность активировать ГТФазную активность 3 в рибосоме. В работе создан широкий спектр точечных мутаций концевого домена . Высказано предположение, что консервативный Туг5 образует водородную связь с , которая вероятно фиксирует ориентацию Туг 5 в молекуле , что важно для узнавания третьего положения в стопкодоне. Показано, что замена концевого домена человека на гомологичный концевой домен 1 инфузории . Выявлен дипептид в концевом домене человека положения 23, замена которого на днпептид , находящийся в аналогичном положении в концевом домене i ii, переключает омнипо рентное гъ фактора на узнавание только стопкодона в гибридных белках. Показано, что гуанин в стопкодоне I образует сшивку с участком 14 , а гуанин стопкодона образует сшивку после 1ого аминокислотного остатка . xxxx, является более протяженной, чем считали ранее и ограничена положениями 12. Результаты представленной работы открывают перспективы для создания теоретической и экспериментальной базы данных которая может быть полезна для изучения РНКбелковых взаимодействий в общем и работы трансляционного аппарата клетки, в частности. Результаты данной работы могут помочь при разработке супрессорных методов лечения онкозаболеваний и других болезней, связанных с появлением нонсенсмутаций. Работа открывает возможность значительно расширить функциональное разнообразие белков путем введения неканонических аминокислот в состав белков с использованием стопкодонов в качестве смысловых. Результаты работы демонстрируют возможность исследования молекулярной машинерии клетки i vi и i viv путем создания широкого спектра мутантных форм белков и гибридных конструкций с помощью относительно простых генноинженерных манипуляций.