Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах

• Автор: Павлова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гены супрессоры опухолевого роста

1.2. Эпигсномныс изменения при канцерогенезе

1.2.1. Эпигеномные процессы

1.2.2. островки и метилирование ДНК

1.2.3. Метилтрансфсразы

1.2.4. Метилирование опухолевого генома

1.3. Локализация ряда на хромосоме 3 человека
1.3.1. Нарушения на хромосоме 3 в карциномах различных органов
1.3.2. Анализ Зр.3С региона
1.3.3. Анализ Зр.3Т АРрсгиона
1.4. Сравнительная геномная гибридизация iv iiii,
1.4.1. Современные методы II на микрочипах
1.4.2. микрочипы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Генетические конструкции для трансфекции клеток
3 и 1
2.1.2. Фрагменты геномной ДНК и кДНК генов
2.1.3. Клеточные линии
2.1 А. Образцы биопсий опухоли и нормальной ткани
2.2. Методы
2.2.1. ИзшговлениеБМмикрочипов
2.2.2. Блокировка микрочипов
2.2.3. Методика получения обогащенных ДНКпроб для
2.2. Методы
2.2.1. Изготовление ЫоЯмикрочипов
2.2.2. Блокировка микрочипов
2.2.3. Методика получения МоНобогащенных ДНКпроб для гибридизации
2.2.4. Гибридизация ИоНобогащенных проб
2.2.5. Анализ результатов гибридизации
2.2.6. Трансфекция и селекция позитивных клонов
2.2.7. Тест на эффективность формирования колоний
2.2.8. Тест на эффективность формирования колоний в жидком агаре
2.2.9. Формирование опухоли в иммунодефицитных мышах
2.2 Стандартные биологические процедуры
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Модификация технологии сравнительной геномной гибридизации с Ыоми кроч и нам и
3.1.1. Иоймикрочипы
3.1.2. Модифицированная технология подготовки ЫоВобогащенных проб ДНК для гибридизации с МоНмикрочипами
3.1.3. Обработка результатов гибридизации
3.1.4. Особенности биоинформатичсской обработки результатов гибридизации
3.1.5. Преимущества метода гибридизации на ЫоПмикрочипах
3.2. Эпигеномные и структурные изменения хромосомы 3, выявленные гибридизацией на МоНмикрочипах в разных типах опухоли
3.3. Анализ метилирования геномных ЫоНлокусов, показавших изменения в результате гибридизации на МоНмикрочипах, с помощью независимых методов
3.3.1. Бисульфитное секвенирование Ыолокусов
3.3.2. Метилспецифичная амплификация локусов
3.4. Анализ метилирования 1 из хромосомы 3 человека и 2 из хромосомы в опухолях и раковых клеточных линиях
3.4.1. Семейство генов
3.4.2. Эпигеномная регуляция гена 2
3.4.3. Анализ метилирования 2 в раковых клеточных линиях молочной железы
3.4.4. Анализ метилирования промоторов генов 2 и 1 в опухоли молочной железы, II и яичника
3.5. Проверка опухольподавляющей способности гена
i vi и i viv
3.5.1. Тест на формирование колоний
3.5.2. Тест на формирование колоний в жидком агаре
3.5.3. Формирование опухоли в иммуннодефицитных мышах
с 2
3.6. Анализ мутационных изменений 1 и 3 из хромосомы Зр человека в образцах опухолей и раковых клеточных
линиях
3.6.1. Частота мутаций в гене 1
3.6.2. Поиск первичных мутаций в гене 1 в клонах из единичной клетки
3.6.3. Частота мутаций 3
3.6.4. Сравнение частоты мутаций в генах 1 и 3 с мутациями в других генах
3.6.5. Влияние мутаций в генах 1 и 3 на их опухольподавляющую способность
3.6.6. Поиск мотивов мишеней в генах и 3
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1 мелкоклеточный рак легкого
МСП метилспецифичная полимеразная цепная реакция
НМРЛ немелкоклеточный рак легкого
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЦРРВ ПЦР в реальном времени
ФБС фетальная бычья сыворотка
5аза2деоксицитидин
i ii ii i, комбинированного
бисульфитного рестрикционного анализа
I iivi , тест на инактивацию гена
i потеря гетерозиготности
рак лгкого
i микрочип
II РНКполимераза II
I тяжлая комбинированная иммунная недостаточность
семейство малых фосфатаз
i додецил сульфат натрия
ii i цитрат натрия
анализ полиморфизма одиночной нуклеотидной цепочки
, генсупрессор опухолевого роста
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В этой связи важной задачей является разработка методик мультиплексного скрининга маркеров канцерогенеза и все большее значение приобретает технология микрочипов, которая позволяет одновременно анализировать десятки тысяч генов. Создание новых ДНКмикрочипов имеет принципиальное значение для получения информации, не доступной на уровне мРНК кДНК гетерозиготные делсции, метилирование ДНК, ацетилирование гистонов. Метилирование и другие эпигеномные факторы, как известно, являются одними из ключевых механизмов регуляции экспрессии генов и играют важную роль в канцерогенезе. Эпигеномные изменения могут быть определены на ранних стадиях заболевания и использованы для ранней диагностики опухолей и прогноза раковых заболеваний. Цслыо данной работы является поиск и характеристика новых геновсупрессоров опухолевого роста на хромосоме 3 человека с помощью технологии гибридизации на ЫоЙмикрочипах. Модифицирование методики сравнительной геномной гибридизации на ЫоИмикрочипах для скринирования хромосомы 3 человека. Анализ геномных и эпигеномных изменений хромосомы 3 человека в образцах опухолей с использованием разработанных Ыоймикрочипов и поиск новых кандидатов в ТЭС. Исследование изменений геномных локусов, выявленных гибридизацией на Ыомикрочипах, с помощью независимых методов метилспецифичной ПЦР МСЛ и бисульфитного секвенирования. Проверка взаимосвязи метилирования генов кандидатов в Т8в с их экспрессией в образцах эпителиальных опухолей. Сравнение данных по метилированию и опухольподавляющей способности ТБв ЛIЛ и ТБвкандидата ИА2 в клеточных линиях и образцах опухолей различной локализации. Оценка способности ТБвкандидата ЯАР2 к подавлению опухолевого роста в культуре клеток и у иммунодефицитных мышей. Определение частоты возникновения мутаций в ТБО ЯАР1А и ЯВ8РЗ хромосомы Зр человека в раковых клеточных линиях и образцах эпителиальных опухолей. В работе модифицирована технология сравнительной геномной гибридизации на ЫогТмикрочипах, созданных с использованием ЫоИсвязующих клонов 2аЬаго5ку е а. У2. Нами использованы МоИмикрочипы для скрининга хромосомы 3 человека, позволяющие одновременно анализировать 1 Ыоассоциированный сайт хромосомы 3. МоИлинкера и стрептавидиновых магнитных шариков, позволяющее избавляться от мечилированных фрагментов ДНК и от повторов геномной ДНК, которые существенно занижают силу сигнала при гибридизации. Отработаны условия машинной гибридизации ДИКпроб на ИоИмикрочипах. Модифицирована математическая обработка результатов гибридизации па микрочипах. С помощью модифицированной технологии сравнительной геномной гибридизации на микрочипах проанализированы геномные и эпигеномные изменения хромосомы 3 человека в 0 образцах эпителиальных опухолей и лейкемии. Показано, что причиной инактивации , локализованных в хромосоме 3, могут быть не только мутации и делеции, но и метилирование их промоторных областей. На основании результатов гибридизации на микрочипах и бисульфитного секвенироваиия метилирование локусов в генах , I9, I, I4, V, 3, 2, 2, , 3 выявлено более чем в образцов опухолей различной локализации. Метилирование генов II2, 9, , 2 при канцерогенезе показано впервые. Обнаружена взаимосвязь между снижением экспрессии гена 2 и метилированием его промоторной области в клетках рака молочной железы, образцах немелкоклеточного рака легкого I II и рака молочной железы. Экспериментально установлено, что обработка с способна восстановить экспрессию 2 в тех раковых клеточных линиях молочной железы, в которых прежде наблюдалось метилирование. В данной работе впервые показана способность гена 2 подавлять рост клеток рака молочной железы i vi и в иммунодефицитных мышах. Обнаружено, что в образцах опухоли почки и II, где метилированы промоторные области генов 2, 3, 1, I9, снижен уровень мРНК этих генов. Впервые выявлена повышенная частота мутаций в генахсупрессорах опухолевого роста iI и 3 и показано, что мутации могут снижать опухольподанляющую способность этих генов. I фактическая ценность работы заключается в модификации методики гибридизации на микрочипах, позволяющей одновременно определять наличие геномных и эпигеномных изменений в геноме опухолевых клеток.