Структурно-функциональное изучение участков инициации трансляции

• Автор: Нгуен Куанг Винь, 0
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 92 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ стр.

ВВЕДЕНИЕ .

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Прокариотические рибосомсвязывающие сайты и их

роль в экспрессии генов .

ГЛАВА П. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Структурнофункциональное изучение участков инициации трансляции

ГЛАВА Ш. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы и материалы

Методы

Ферментативные обработки ДЕК .

Электрофорез и детектирование фрагментов ДЕК .
Элюция фрагментов ДНК из геля.
Приготовление компетентных клеток Е.i и их
трансформация плазмидной ДНК
Анализ клонов методом гибридизации с меченными
фрагментами ДЕК
Аналитическое и препаративное выделение плазмидных
Определение нуклеотидной последовательности ДНК
Определение галактозидазной активности
Конструирование ПЛаЗМИД 2
V1 И V2 .
V5 И V6
серии V4 .
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Трансляционная регуляция, главным образом осуществляется на стадии инициации, по объему проведенных исследований и изучен ности значительно уступает транскрипционной регуляции, хотя она также способна сильно влиять на экспрессию генов. Поэтому актуальной задачей являются поиск и исследование оптимальных участков инициации трансляции, с помощью которых можно создать более эффективные векторы для экспрессии генов в бактерии. Такие исследования стали возможными благодаря развитию современных методов генетической инженерии и нуклеотидного синтеза, позволяющих исследователям выделять из генома бактерии или химически синтезировать различные рибосомсвязывающие сайты, а также направленно варьировать их размер и нуклеотидный состав. В связи с этим целью настоящей работы являлось изучение влияния различных рибосомсвязывающих сайтов, химически синтезированных и целенаправленно измененных по величине и нуклеотидному составу, на экспрессию клонированного гена. Для этого необходимо было создать специальную векторную плазмиду, позволяющую легко клонировать и точно определять функциональную активность исследуемых рибосомсвязывающих сайтов. В структуру этой векторной плазмиды входят синтетические цромотор и участок инициации трансляции, а также i, продукт которого ргаяактозидаза легко тестируется биохимически. Штамм . Благодаря наличию удобных рестриктных сайтов в векторной плазмиде можно вводить различные рибосомсвязывающие сайты и исследовать их влияние на экспрессию ргалактозидазы. Диссертационная работа выполнена в период года и является частью комплексных исследований, проводимых в лаборатории химии генов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР под руководством академика М. Н.Колосова, которому автор искренне признателен за постоянное внимание и поддержку. Автор выражает глубокую благодарность старшему научному сотруднику лаборатории кандидату химических наук В. Г.Коробко за научное руководство настоящей диссертацией и практическую помощь на протяжении всего периода ее выполнения, а также кандидату химических наук В. Н.Добрынину и его сотрудникам за синтез олигонуклеотидов, использованных в этой работе. В экспериментах по изучению инициации трансляции i vi, когда вместе с рибосомой при определенных ионных условиях инкубировали мРНК, тИЖ, факторы инициации и было обнаружено, что рибосома способна узнавать специфическую область на мРНК и формировать по ее сигналу инициирующий комплекс I, 2, 3 . Если при этом в смеси отсутствуют компоненты, ответственные за последующую элонгацию аминоацилтРНК, факторы элонгации то рибосома будет прочно связываться с этой областью и защищать ее от действия рибонуклеаз. Эта область мессенджера была названа участком инициации трансляции, или рибосомсвязывающим сайтом. Он представляет собой участок мРНК длиной нуклеотидов, содержащий инициирующий кодон соответствующего гена на расстоянии нуклеотидов от 3конца защищенного фрагмента. Число известных рибосомсвязывающих сайтов растет с каждым годом благодаря успехам методологии секвенирования нуклеиновых кислот и к настоящему времени уже установлена нуклеотидная последовательность около 0 участков 4, 5 . Прежде чем приступить к решению основных воцросов какие главные факторы детерминанты определяют функциональную силу рибосомсвязывающих сайтов РНК транслируются эффективнее, чем другие Инициации трансляции прокариот как одному из ступеней в сложном процессе реализации генетической информации было посвящено большое число исследований обзоры 47 . Согласно современному цредставлению главным образом основано на данных в . I1I3. I1 . II2. . .I1. I3. I2ЗОЯ. ТГ1. I3. . . I1. I3. I1. I3 . .I1 . I3. . I. .I. I3. . . I2. .I1. I3. . . . I1. I3. . . I2 . 5 . . ПЛЕНА. . . I2 Ш а ИЛИ С тИНА Ш в. У стабильный зоб инициирующий комплекс. Участие третьего инициирующего фактора 1П в формирование зоб инициирующего комплекса еще мало изучено.