Сравнительная активность in vivo главных промоторов бактериофага XI74, G2 фага FD и laguv5 E. coli.

• Автор: Федченко, Валерий Иванович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИИ ПРОМОТОРОВ

ПРОКАРИОТОВ

I.I. ОЕЦИЕ ЧЕРТЫ СТРУКТУРЫ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ

1. Структурная гомология рамки ПрибноваШаллера у

промоторов, узнаваемых РНКполимеразой Б. i

2. Область нуклеотида

3. Другие функциональнозначимые участки в нуклеотидной последовательности промотора .

I ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ . .

1. Особенности структур промоторов, узнаваемых РНКполимеразами бактериофагов и РНКполимеразой бактерий, модифицированных бактериофагом .
2. Особенности структуры промоторов, узнаваемых РНКполимеразой е. i
II. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГШАЗМИДНЫХ ВЕКТОРОВ В ИЗУЧЕНИИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ .
III. БАКТЕРИОФАГ 0X4 И ЕГО ТРАНСКРИПЦИЯ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. ВЫДЕЛЕНИЕ И КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК, СОДЕРЖАЩИХ
ПРОМОТОРЫ А, В И БАКТЕРИОФАГА 0X4
1. Выделение фрагментов ДНК, содержащих промоторы
2. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих промоторы,
в плазмиде 4
3. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих промоторы,
в плазмиде .
II. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОМОТОРОВ БАКТЕРИОФАГА 0X4 . .
1. Определение активности промоторов по экспрессии пн плазмида рВДН4.
2. Определение активности промоторов по экспрессии пн плазмида рШб8
3. Влияние числа копий промотора на экспрессию оперона.
III. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОМОТОРА В БАКТЕРИОФАГА 0X4
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Кроме того, разработан новый метод выделения ДНКполимеразы I i ii, препараты которой целесообразно использовать в работах по генной инженерии вместо фрагмента Кленова ДНКполимеразы I . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Т. ОНЦИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СТРОЕНИЯ И ШУНКЦИИ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ. Анализ первичной структуры большого числа прокариотических промоторов, изученных к настоящему времени, выявляет значительные различия в их нуклеотидной последовательности. Это, повидимому, связано с функциональной специфичностью промоторов, лежащей в основе многообразия регуляторных процессов. Изучение и понимание этих процессов усложняется существованием многочисленных молекулэффекторов, позитивно или негативно влияющих на взаимодействие РНКполимеразы с промотором. Однако, несмотря на большое разнообразие первичной структуры индивидуальных промоторов, высокое сродство РНКполимеразы к этим сравнительно коротким фрагментам ДНК позволяет предполагать существование в них некоторых общих структурных особенностей. И в самом деле, статистический анализ первичной структуры большого числа промоторов привел к обнаружению ряда одинаковых для большинства промоторов нуклеотидных последовательностей и созданию структуры среднестатистического, идеального промотора. Очевидно, что изучение структурнофункциональных особенностей промоторов очень важно для понимания механизмов регуляции экспрессии генов. ОБЩИЕ ЧЕРТЫ СТРУКТУРЫ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ. При взаимодействии с ДНК РНКполимераза вначале образует нестабильные комплексы, которые при определенных условиях трансформируются в стабильные, способные к немедленной инициации синтеза РНК , , . ДНК. При добавлении к минимальному ферменту фактора на двуцепочечной ДНК образуется ограниченное число прочных специфических бинарных комплексов Г I. Предполагается, что субъединица вызывает конформационные изменения в минимальном ферменте, которые повышают сродство к нуклеотидной последовательности промотора, а степень и скорость образования инициирующего комплекса, в значительной мере, определяется структурой промотора , 0, I8I . Использование свойства холофермента РНКполимеразы образовывать с промоторами стабильные комплексы, устойчивые к действию нуклеаз, дало возможность препаративно выделить защищаемые участки ДНК и проанализировать первичную структуру целого ряда промоторов , , I, I . Усовершенствование метода определения первичной структуры ДНК позволило установить нуклеотидные последовательности значительного числа промоторов и локализовать ряд мутаций, затрагивающих функционально значимые участки промотора. При сопоставлении первичной структуры большого числа промоторов были выявлены общие закономерности их строения, такие, как рамка ПрибноваШаллера, зоны нуклеотидов и , а также некоторые другие особенности. Структурная гомология рамки ПрибноваШаллера у промоторов, узнаваемых РНКполимеразой В. Первое сопоставление промоторных участков, защищаемых РНКполимеразой от действия нуклеаз, провел Прибнов в США 8, 9 и Шаллер в ФРГ 4 рис. РНК. Авторы высказали предположение о том, что эта зона играет важную роль в узнавании промотора РНКполимеразой и образовании с ней стабильного комплекса. Усредненная гептануклеотидная последовательность ТАТРиАТО получила впоследствии название рамки Прибнова РгЗЛшогг Ъох или рамки ПрибноваШаллера. Ъйаа Туг 1ЯША 1ас тс . Рис. Т. Сопоставление нуклеотидных последовательностей ряда промоторов значащей цепи ДНК по 8, 9ТАТРиАТО усредненная последовательность, выведенная на основе представленных структур и получившая название рамки ПрибноваШаллера. Подчеркнут стартовый нуклеотид синтеза РНК. В настоящее время появились достаточно серьезные обобщения структуры прокариотического промотора, основанные на обширном фактическом материале 7, 4,7. На рис. Г 4 . СССС6ААА I ТАСТАТТТббТАТААТОС бТТАТАСбС. ТбТАТСАб С6д СС АТС ДАТ. Рис. Среднестатистическое распределение нуклеотидов в структуре промотора, среднестатистическая первичная структура промотора и положение точковых мутаций по 47. Стрелки, направленные вверх и вниз, показывают, что данная мутация соответственно повышает или понижает эффективность промотора.