Изучение организации фосфат-связывающей области бактериальных уридинфосфорилаз

• Автор: Чеботаев, Дмитрий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Тканевая локализация пиримидгшнуклеозидфосфорилаз в организме человека. Роль их биологической активности в нормальных и патологических процессах, а также химиотерапии онкозаболеваний.

1.1. Введение.

1.2. Общая характеристика пиримидиннуклеозидфосфорилаз человека.

Роль их структуры и ферментативных свойств в проявлении ими биологической активности i vi и i viv
1.3. Тканевая локализация пиримидиннуклеозидфосфорилаз и их роль в нормальных и патологических процессах в организме человека.
1.4. Возможности использования индукции и ингибирования ферментативной активности пиримидиннуклеозидфосфорилаз

i viv при химиотерапии онкозаболеваний

Глава 2. ЭКСГШРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Ферменты
2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.2. Методы
2.2.1. Общие методы
2.2.2. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов
2.2.3. Амплификация фрагментов ДНК.
2.2.4. Сайтнаправленная реконструкция ДНК.
2.2.5. Анализ структуры ДНК
2.2.6. Выделение нативных бактериальных ЦРаз и их мутантных и
и гибридных форм .
2.2.7. Изучение ферментативных свойств нативных бактериальных иРаз и их мутантных и гибридных форм.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Общая характеристика ЦРазы из .i
3.2. Клонирование и экспрессия в клетках Е. i гена иРазы из i .
3.3. Структура и свойства бактериальных ЦРаз.
3.4. Получение, клонирование и экспрессия в клетках Е. i генов гибридных ЦРаз. Анализ свойств гибридных белков
3.5. Сравнительный анализ топологий вторичных структур ЪтРазы из
.i К и ряда функционально родственных ей ферментов
3.6. Исследование функциональной роли остатков дикарбоновых аминокислот и остатка Туг ЦРазы из .i
3.7. Локализация функционально важных аминокислотных остатков фрагмента Ргоб 1 Рго полипептидной цепи иРазы Е. i, входящих в состав фосфатсвязывающей области активного
центра
3.8. Изучение роли остатков и в функционировании
ЦРазы из . i.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В частности, было убедительно показано, что в гексамере ЦРазы из Е. И К отсутствуют как внутри, так и межмолекулярные дисульфидные связи. Были локализованы аминокислотные остатки Суя 6, Из 2 которые участвуют в поддержании активной структуры фермента. Предполагалось, что фрагмент полипептщщой цепи Рго Рго белка отвечает за связывание фосфат иона и, как и остаток РПз8, принимает участие в формировании активного центра . Таким образом, к началу исследований, результаты которых представлены в данной работе, мало что было известно о структуре активного центра ЦРазы из Е. И К и конкретных аминокислотных остатках, принимающих участие в связывании и превращении субстратов. Вышеизложенное и определяет актуальность темы исследования. Цель работы. Целью работы являлась локализация с помощью сайт направленного мутагенеза функционально важных участков полилептидных цепей и аминокислотных остатков бактериальных ЦРаз на примере данного фермента из . К. Научная новизна работы. В работе впервые клонирован ген ЦРазы из i и определена его нуклеотидная последовательность 4. Сконструирована экспрессной ная плазмида и получен рекомбинантный штаммсуперпродуцент данного белка. Проведено выделение ЦРаз из i и ii, и сравнительное с ЦРазой из . К изучение их ферментативных свойств. Показано, что ферменты из . К и . Методами сайтнаправленной реконструкции ДНК получены гены гибридных ферментов, состоящих из фрагментов полипептидных цепей ЦРаз из . . ii. Созданы рекомбинантные штаммы суперпродуценты соответствующих белков, с повышенной, по сравнению с ЦРазой . Методом сайтнаправленного мутагенеза в аминокислотную последовательность уридинфосфорилазы из Е. К был внесен ряд точечных и двойных замен. Мутантные белки выделены и исследованы их ферментативные характеристики. На основании сравнения полученных величин констант Михаэлиса и активности ЦРазы из Е. Проведено сравнение известных на современном этапе результатов исследования структурнофункциональной организации иРазы из . К, полученных методами сайтнаправленного мутагенеза, РСА и селективной химической модификации. Практическая ценность работы. Представляемая работа является частью проводимой в ГУЛ ТосНИИгенетика комплексной программы темы . Регистрационный номер темы 7 исследования структурно функциональных отношений в ЦРазе из . К. Раз с повышенной, по сравнению с ЦРазой из . ЦРаз из разных организмов. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 9 страницах машинописного текста и содержит рисунков и 5 таблиц. Библиография включает в себя 5 названий. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ТКАНЕВАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПИРИМИДИННУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА. РОЛЬ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В НОРМАЛЬНЫХ И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ, А ТАКЖЕ ХИМИОТЕРАПИИ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ. Введение. Фосфорилазы нуклеозидов ферменты, осуществляющие в присутствии ортофосфата обратимый фосфоролиз нуклеозидов до гетероциклического основания и пентозо1фосфата. У микроорганизмов они входят в состав системы транспорта и утилизации нуклеозидов, позволяющей бактериальным клеткам расти на средах, содержащих нуклеозиды в качестве единственного источника углерода и азота 1. По субстратной специфичности эти ферменты делятся на пурин и пиримидиннуклеозидфосфорилазы РИРазы и 3. С фосфорилазами нуклеозидов в клетке связана также функция переноса остатка пентозы между гетероциклическими основаниями . Путь катаболизма пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов был ранее охарактеризован для . . ii, отчасти у i . и других про и эукариотов 1,,. Для большинства изученных организмов показано наличие двух вовлеченных в цикл утилизации пиримидиновых нуклеозидов РуЫРаз, специфичных к рибозному и дезоксирибозному остаткам уридиифосфорилазы ЦРазы и тимидинфосфорилазы ТРазы.