Эндорибонуклеазная активность протеасом и α-РНП частиц и особенности ее регуляции в клетках К562

• Автор: Миттенберг, Алексей Георгиевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 137 с.

Оглавление
I. Введение

II. Обзор литературы

1. Протеасомы

1.1. протеасомы

1.2. протеасомы

1.3. Регуляторные комплексы протеасом

1.3.1. регуляторный комплекс

1.3.2. РА комплекс

1.4. Фосфорилирование протеасом

1.5. Локализация протеасом в клетке

2. Функции и активности протеасом
2.1. Убиквитинзависимый протеолиз
2.2. Участие протеасом в убиквитиннезависимом протеолизе
2.3. Регуляция транскрипции
2.4. Регуляция клеточного цикла
2.5. Протеасомы и рак
2.6. Протеасомы и апоптоз
2.7. Взаимодействие протеасом с вирусными белками
2.8. Роль протеасом в формировании долговременной памяти
2.9. Эндорибонуклеазная активность протеасом
3. аРНП рибонуклеопротеиновый комплекс, содержащий просомы
III. Материалы и методы
1. Культивирование клеток
2. Выделение РНК
3. Электрофоретический анализ РНК
3.1. Электрофорез РНК в нативных условиях
3.2. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях
4. Выделение аРНП
5. Выделение протеасом
6. Обработка РНК с помощью протеасом и аРНП
7. Мечение препаратов нуклеиновых кислот
7.1. Мечение ДНК с использованием случайных праймеров
7.2. Мечение РНК по Зконцам
7.3. Мечение нуклеиновых кислот по 5концам
8. Транскрипция i vi
9. Блок транскрипции и импорт протеасом из культуральной жидкости
. Нозернблот гибридизация ДНКРНК
. Иммунофлуоресцентный анализ
. Материалы
IV. Результаты и обсуждение
1. Протеасомы и аРНП проявляют эндорибонуклеазную активность
2. Индукция эритроидной дифференцировки в клетках К2 приводит к повышению активности эндонуклеазы протеасом и аРНП
3. Продукты нуклеолиза высокомолекулярных РНК аРНП комплексом содержат свободные ОНгруппы на Зконцах
4. Активность нуклеазы протеасом и аРНП зависит от двухвалентных катионов
5 Дефосфорилирование белковых субъединиц подавляет нуклеазу протеасом и аРНП
6. Воздействие на протеасомы и аРНП протеиназой К подавляет их эндорибонуклеазную активность
7. Денатурация субстрата способствует его более эффективной деградации рибонуклеазой протеасом
8. Деградация протеасомами содержащих мРНК осуществляется как i vi, так и i viv
9. Протеасомы и аРНП осуществляют специфический
эндонуклеолиз мРНК протоонкогена стус и гена опухолевого
супрессора р
. Нуклеазы протеасом и аРНП из клеток К2 способны специфически деградировать чужеродную для этих клеток
РНК мРНК люциферазы Яела эр.
. Индукция гемином дифференцировки по эритроидному пути приводит к изменению субъединичного состава протеасом в клетках К2 и выходу их в цитоплазму
Выводы
Список сокращений
Список литературы


Открытие убиквитинпротеасомного пути деградации белков высокоспецифичной, строго контролируемой и зависимой от энергии АТФ системы, позволило разрешить множество загадок, связанных с путями деградации внутриклеточных белков. Однако функция протеасом в клетке не ограничивается одним лишь протеолизом. Помимо широко и всесторонне исследованных протеолитических активностей, они обладают еще и эндорибонуклеазной, в результате проявления которой расщеплению подвергаются различные типы молекул РНК от вирусных . i . РНК высших эукариот Евтеева и др. Куличкова и др. Настоящая работа посвящена изучению эндорибонуклеазной активности двух регуляторных комплексов клетки протеасом и аРНП, обладающих сходными физикохимическими и биохимическими свойствами. Будучи впервые обнаруженными электронномикроскопическими методами более лет назад i, , мультикаталитические протеиназы протеасомы, просомы в последние десятилетия привлекли к себе пристальное внимание множества исследователей во всем мире. Было обнаружено, что распространение протеасом не ограничивается клетками эукариот. Более просто организованные, но структурно поразительно похожие, аналогичные комплексы были выявлены у архебактерии ii . . Протеасомы эукариот демонстрируют высокий эволюционный консерватизм i . Структура и субъединичный состав протеасом растений . i . . , , амфибий ii . i . . x . Исследования последних лет показали, что с коровыми частицами, выделенными из клеток человека, могут связываться эволюционно близкие им мышиные РА0 регуляторные комплексы i . Но еще более ярким подтверждением консерватизма субъединиц протеасом может являться обнаруженная несколько лет назад способность комплексов человека к стимуляции протеолиза протеасомами дрожжей . протеасома представляет собой АТФзависимый протеиназный комплекс с молекулярной массой около 2 МДа. Коэффициент седиментации был получен в результате центрифугирования комплекса в градиенте плотности глицерина, в то время как по данным аналитического ультрацентрифугирования, константа Сведберга для настоящего комплекса составляет порядка i . В состав протеасомы см. протеасомой, а также два больших Vобразных концевых модуля 8частицы, выполняющих регуляторные функции и присоединенных к центральному элементу в противоположной ориентации , i, iv . . протеасомы. Да , . x . , . Семь гомологичных а и Б. Кольца ассоциированы в порядке i, , . концы асубъединиц обращены внутрь полости частицы, перекрывая тем самым доступ в протеолитическую камеру, что говорит о наличии ворот в канале корового комплекса . конец субъединицы аЗ несколько отличается от таковых у прочих асубъединиц тем, что пересекает поверхность кольца в направлении центра симметрии, контактируя при этом со всеми остальными асубъединицами. Для входа субстрата внутрь коровой частицы, равно как и для выхода из ее полости продуктов протеолиза, необходимо перемещение блокирующих выход концов асубъединиц i, iv, . Несмотря на то, что все семь асубъединиц связаны генетически у дрожжей они идентичны друг другу примерно на , их концевые участки отличаются друг от друга как по последовательностям аминокислот, так и по относительной длине . В то же время, эти концевые области каждой из субъединиц высококонсервативны и практически одинаковы у множества разных видов, что говорит о важной структурной роли, которую играют концы асубъединиц в коровых частицах всех эукариотических организмов i, iv, . Пептидазная активность коровых частиц эукариот может стимулироваться рядом воздействий. Так, например, стимуляция происходит при ассоциации их с регулятором, с образованием протеасомы . i . Кроме того, эндогенным активатором протеасом служит комплекс РА, индуцируемый интерфероном у i . .