Гомеобоксные гены X-nkx-5.1, Dlx5 и Dlx2 в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis и их роль в регуляции экспрессии гомеобоксного гена Xanf-1

• Автор: Байрамов, Андрей Вячеславович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

1. Поиск транскрипционных факторов, связывающихся с регуляторным элементом промотора гена X1, при помощи одиогибридиой дрожжевой системы.

2. Геи Xx5.1 шпорцевой лягушки.

2.1. Клонирование кДПК гена Xx5.1.

2.2. Экспрессия гена Xx5.1 в раннем развитии шпорцевой лягушки.

3. Транскрипционный фактор Xx5.1 играет роль регулятора экспрессии гена X1 в раннем развитии шпорцевой лягушки.
3.1. Динамика экспрессии гена Xx5.1 в нервной тастинкс обнаруживает обратную корреляцию с динамикой экспрессии гена X
3.2. Исследования, проведенные с помощью метода торможения ДНКбелковых комтексов в геле , указывают на способность Хпкх

5.1 связываться с регуляторным элементом промотора гена X1

3.3. Хпкх5.1 может ингибировать экспрессию гена X1 с эмбрионах шпорцевой лягушки.

3.4. Микроинъекции мРНК доминантноактиваторной конструкции, содержащей гомеодомен Xx5.1 VXx5.1гд, вызывают
комтскс морфологических аномалий, характерный для случаев эктопической экспрессии гена X1.
3.5. Транскрипционный фактор Хпкх5.1 напрямую взаимодействует с регуляторными элементами гена X1.
3.6. Подавление трансляции эндогенной мРНК Хпкх5.1 путем микроинъекций антисмыслосых морфолиновых олигонуклеотидов вызывает пространственное расширение и продление экспрессии гена X1 в перепой тастинкс зародышей шпорцевой лягушки.
4. Роль гена Xx5.1 в развитии шпорцевой лягушки.
4.1. Роль гена Xx5.1 в развитии головного мозга не ограничивается регуляцией экспрессии гена X1.
4.2. Транскрипционный фактор Xx5.1 регулирует экспрессию нейроспсцифических генов регуляторов развития головного мозга.
4.3. Гi Хпкх5.1 вовлечен в процесс дифференцировки эпидермальных ресничных клеток.
5. Роль генов x5 и x2 в регуляции экспрессии гена X1 шпорцевой лягушки X vi.
5.1. Транскрипционный фактор x5 может выступать в роли прямого ингибитора экспрессии гена X1.
5.2. Транскрипционный фактор x5 оказывает непосредственное влияние па экспрессию гена X1.
5.3. Подавление трансляции эндогенной мРПК x5 в зародышах шпорцевой лягушки приводит к расширению области экспрессии гена X1.
5.4. Транскрипционный фактор x2 может опосредованно
ингибировать экспрессию гена X1.
5.5. Подавление трансляции эндогенной мРНК x2 с зародышах шпорцевой лягушки приводит к расширению области экспрессии гена X1.
Обсуждение.
1. Экспрессия гена Xx5.1 с раннем развитии шпорцевой лягушки.
2. Роль гена Xx5.1 в раннем развитии шпорцевой лягушки.
2.1 Роль Xx5.1 в регуляции экспрессии гена X1. .
2.2. Роль Хпкх5.1 в развитии передней нейрожтодермы шпорцевой лягушки.
2.3. Роль Хпкх5.1 в дифференцировке эпидермальных реснитчатых
кз сток.
3. Роль генов x5 и x2 в регуляции экспрессии гена X1.
Выводы.
Материалы н методы.
1. Материалы.
1.1. Реактивы.
1.2. Ферментные препараты.
1.3. Лабораторное оборудование.
1.4. Лабораторные животные.
1.5. Буферы и растворы.
1.6. Миробиологическис среды.
1.1. Предоставленные пзазмиды.
1.8. Предоставленные iзонды.
2. Методы.
2.1. Ампзификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции ПЦР.
2.2. Определение нукзеотидной последовательности ДНК.
2.3. Получение 5 концевого фрагмента кДК Хпкх5.1 при помощи метода быстрой амтификации концевых фрагментов кДНК СЕ.
2.4. Изготовление ДИК конструкций.
2.4.1. Iзготовление конструкций содержащих ДНК Xx5.1.
2.4.2. Изготовление конструкций, содержащих ДНК x5 и x2.
2.5. Транскрипция i vi.
2.6. Получение зародышей шпорцевой лягушки. Микроипъскции синтетических мРПК в зародыши шпорцевой лягушки.
2.7. Блокирование трансляции эндогенной мРПК при помощи
микроинъекций антисмысловых Морфолиио Олигонуклеотидов МО.
2.8. Синтез iмеченых гибридизтионных зондов.
2.9. Фиксация зародышей.
2 Гибридизация i i.
2 Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки.
Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция .
2 Одногибридная дрожжевая система.
2 Исследование торможения ДНКбелковых комтсксов в геле
.
Благодарности.
Список сокращений.
Список литературы


Па сегодняшний день известно уже несколько десятков классов гомсобоксиых генов, каждый из которых характеризуется специфической последовательностью гомеодомена . Один из представителей гомсобоксиых генов ген X1 был обнаружен у амфибий X vi при поиске генов, специфически экспрессирующихся в раннем зачатке переднего мозга. Само название гена отражает специфичность области его экспрессии Xii i передний нервный валик эмбриона Xii Рис. Гомологи гена X1 были обнаружены и у других представителей позвоночных, в частности, человека, мыши, курицы, тритона, i i, осетра . Оказалось, что кодируемые этими генами транскрипционные факторы образуют отдельный класс гомсодомсиных белков. Исследования показали, что гены данного класса являются одним из ключевых звеньев молекулярного механизма, обеспечивающего развитие переднего мозга у позвоночных Зарайский, . Геи X1 является наиболее ранним из известных маркеров зачатка переднего мозга i . Экспрессия его начинается па стадии гаструлы в области нейроэктодермы, которая в последствии дифференцируется в зачагок переднего мозга Рис. Ст. Рис. I. Область экспрессии гена X1 на стадии нейрулы Л в дальнейшем развивается в передний мозг Б, стрелка. В экспрессия i под контролем промотора гена X1 обнаруживаегся в области переднего мозга. Своевременное снижение уровня экспрессии X1 внутри нервной пластинки является важным фактором нормального развития нейральных структур. Аномальное продление экспрессии гена X1 в передней части нервной пластинки приводит к нарушению экспрессии ряда нейральных маркеров, таких как 1, x2 и Рах6 и морфологическим аномалиям развития структур переднего мозга v . Эктопическая экспрессия гена X1 также приводит у амфибий к развитию аномальных выростов переднего и среднего отделов мозга v . При этом клегки формирующихся выростов дифференцируются каждый раз по типу того отдела мозга, на котором развивается данный аномальный вырост. Это указывает на то, что, хотя экспрессия X1 и является необходимым условием для развития переднего мозга, сама по себе она не достаточна для его дифференцировки. По всей видимости, экспрессия X1 стимулирует развитие полипотентной нервной ткани переднеголовного типа, которая уже в дальнейшем, под воздействием дополнительных региональноспецифических сигналов, способна дифференцироваться в передний мозг v . Зарайский,
Белок X1 является транскрипционным рспрсссором и способен подавлял экспрессию, по меньшей мере, двух генов регуляторов развития задних отделов мозга x2 и Рахб v а 1. В то же время, экспрессия X1 в передней части нервной пластинки косвенно необходима для активации таких регуляторов развития переднего мозга, как , 2, 8, x2. Зарайский, . Другие представители класса также играют важные роли в развития переднего мозга. Так, мутации, нарушающие экспрессию, мышиного гомолога X1 гена xx приводят к нарушениям развития переднего мозга и глаза синдром сситооптической диплазнп i . Отсутствие генов класса в расшифрованных геномах беспозвоночных организмов коррелирует с отсутствием у них анатомических структур, гомологичных переднему мозгу позвоночных. Появление генов класса у позвоночных могло быть одним из событий, приведших к возникновению у них в процессе эволюции этого отдела центральной нервной системы. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что развитие передних отделов мозга у позвоночных стало возможным в результате подавления в передней части формирующейся нервной трубки экспрессии тех генов, которые у предков позвоночных регулировали в этой области развитие структур, гомологичным задним отделам мозга позвоночных. И ген X1 шпорцевой лягушки, возможно, является одним из звеньев данного механизма ингибирования. Действительно, гомсобоксиыс гены x2 и Рахб в нервной пластинке ближайших родственников позвоночных, асцидии и ланцетника, экспрессируются вплоть до переднего края нервной пластинки. У позвоночных же их экспрессия оказывается подавленной в центральном секторе передней части нервной пластинки, т. Именно в этой области экспрессируется ген X1, продукт которого способен подавлять экспрессию x2 и Рахб v .