Одновременный количественный иммуноанализ маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови на биологическом микрочипе

• Автор: Савватеева, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Опухолевые маркеры.

1.1.1. Индивидуальные опухолевые маркеры.

1.1.1.1. Простатспецифический антиген

1.1.1.2. Альфафегопротеин

1.1.1.3. Раковоэмбриональный антиген

1.1.1.4. Хорионический гонадотропин человека.

1.1.1.5. Нейронспецнфичсская енолаза

1.1.2. Одновременное определение нескольких онкомаркеров
1.2. Белковые микрочипы
1.3. Белковые микрочипы для определения онкомаркеров.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Приборы и реактивы
2.2. Буферные растворы.
2.3. Приготовление смеси флуоресцентиомеченных проявляющих
антител.
2.4. Приготовление калибровочных проб и хукобразцов
2.5. Изготовление белковых микрочипов
2.6. Сэндвичиммуноанализ на биочипах
2.6.1. Одностадийный анализ.
2.6.2. Двустадийный анализ
2.7. Флуоресцентные измерения
2.8. Обработка результатов анализа.
2.9. Аналитические характеристики метода.
2.9.1. Воспроизводимость анализа
2.9.2. Аналитическая чувствительность.
2.9.3. Тест на открытие.
2.9.4. Тест на линейность.
2 Твердофазный иммуноферментный анализ на луночном
планшете
21. Определение общей формы простатспецифического
антигена
22. Определение свободной формы простатспецифического
антигена
23. Определение альфафетопротеина
24. Определение раковоэмбрионального антигена
25. Определение нейронспецифической енолазы
26. Определение хорионического гонадотропина
человека
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Биочип для одновременного количественного анализа шести
онкомаркеров.
3.1.1. Выбор пар моноклональных антител для каждого
онкомаркера.
3.1.2. Иммобилизация антигенов
3.1.3. Структура би о чипа.
3.2. Метод одновременного определения шести онкомаркеров в сыворотке крови на биочипе
3.2.1. Концентрации иммобилизованных и проявляющих
антител.
3.2.2. Состав калибровочных проб.
3.2.3. Температура и время инкубации.
3.2.4. Соотношение объемов проявляющие
антителаобразец
3.3. Аналитические характеристики количественного анализа шести онкомаркеров на биочипах
3.3.1. Воспроизводимость анализа
3.3.2. Аналитическая чувствительность.
3.3.3. Тест на открытие.
3.3.4. Тест на линейность.
3.4. Определение содержания шести онкомаркеров в сыворотках
крови.
3.5. Хукэффект
3.5.1. Двустадийный сэндвичиммуноанализ на биочипах
3.5.2. Сдвиг хукэффекта в область более высоких
концентраций.
3.5.3. Способ выявления хукэффекта.
3.5.4. Анализ сывороток с высоким содержанием
анапита
3.6. Хранение биочипов и наборов реагентов для иммуноанализа на биочипах.
3.7. Практическая значимость полученных результатов
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. ВВЕДЕНИЕ. Опухолевые маркеры. Индивидуальные опухолевые маркеры. Хорионический гонадотропин человека. Белковые микрочипы для определения онкомаркеров. ГЛАВА 2. Буферные растворы. Одностадийный анализ. Обработка результатов анализа. Аналитические характеристики метода. Аналитическая чувствительность. Тест на открытие. Тест на линейность. ГЛАВА 3. Структура би о чипа. Состав калибровочных проб. Температура и время инкубации. Аналитическая чувствительность. Тест на открытие. Тест на линейность. Способ выявления хукэффекта. Хранение биочипов и наборов реагентов для иммуноанализа на биочипах. ВЫВОДЫ. ИМБ РАН Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Своевременная диагностика одна из основных проблем онкологии. В настоящее время для ранней диагностики первичной опухоли и ее метастазов, а также мониторинга проводимой терапии широко используется определение опухолевых маркеров в сыворотке крови. Идеальный онкомаркер должен обладать высокой специфичностью и чувствительностью в отношении определенного вида опухоли, однако большинство известных в настоящее время опухолевых маркеров не отвечает этим критериям. Одновременное определение нескольких онкомаркеров повышает эффективность скринингового анализа и увеличивает возможности дифференциальной диагностики заболеваний. Большинство иммунохимических методов позволяет выявлять содержание только одного маркера в одном клиническом образце, поэтому в настоящее время большие надежды в области диагностики рака связывают с использованием мультиплексных систем, таких как микрочипы. В иммунодиагностических системах, основанных на сэндвичпринципе анализа, при высоких концентрациях аналита в пробе возможно возникновение так называемого хукэффекта, при котором зависимость величины регистрируемого сигнала на твердой фазе от концентрации аналита становится обратно пропорциональной. В традиционных тестсистсмах проявление хукэффекта можно выявлять и контролировать, только используя последовательные разведения анализируемого образца. Целью данного исследования является разработка метода одновременного количественного определения шести маркеров онкологических заболеваний в сыворотке крови человека на биологическом микрочипе. Разработанный метод должен также обеспечивать выявление хукэффекта непосредственно в ходе проведения анализа. ГЛАВА 1. В связи с ростом заболеваемости и низкими показателями выживаемости больных после появления клинических признаков заболевания в последнее время возрастает необходимость внедрения простых и неинвазивньтх методов для ранней диагностики раковых опухолей. Однако провести цитологические и гистологические исследования, а также иммунологическую идентификацию опухолевых клеток до операции часто бывает невозможно изза труднодоступности опухолевого очага, который может иметь различное происхождение. Особенно трудной является дифференциальная диагностика раковых и лимфоидных опухолей, требующих различного лечения оперативного вмешательства или специфической химиотерапии. Для диагностики первичной опухоли и ее метастазов, а также мониторинга лучевой и химиотерапии наиболее приемлемым методом является определение онкомаркеров в сыворотке крови. В классическом понимании онкомаркеры это антигены, которые могут быть выявлены в опухолевой ткани, и циркулируют в кровотоке онкологических больных. Опухолевые маркеры представляют собой макромолекулы в основном белки с углеводным или липидным компонентом 1. Диагностическая значимость опухолевого маркера зависит от его чувствительности и специфичности. Идеальных маркеров, т. До сих пор не удалось разработать ни одного строго опухолеспецифичного теста, способного определять только злокачественную опухоль данного типа и обеспечить е локализацию на возможно более ранних этапах формирования.