Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови

• Автор: Розов, Федор Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

1. Актуальность проблемы.

2. Цель работы.

3. Основные задачи.

4. Научная новизна и практическое значение работы

5. Основные положения, выносимые на защиту.

6. Благодарности

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Современные п редставления о гемопоэзе

1.2. Ниша стволовой клетки костного мозга

1.2.1. Ниша стволовой клетки в эндостале.

1.2.2. Васкулярная ниша СКК

1.3. Сигнальные пути, регулирующие самоподдержание
и диффереицировку СКК и клетокпредшественников
1.3.1. Передача сигнала через рецепторы
1.3.2. Апгиопоэтипы и передача сигнала через рецепторы i
1.3.3. Транскрипционные факторы группы НОХ.
1.3.4. Молекулы и передача сигнала через рецепторы
1.3.5. Белок i2.
1.3.6. Рецепторы .
1.3.7. Адгезионные взаимодействия гемопоэтических клеток
со стромальным окружением
1.4. Передача сигнала через рецепторы и их роль в гемопоэзе
1.4.1. Роль рецепторов в дифферениировке клеток. Гомотипические и гетеротипические модели взаимодействия
1.4.2. Молекулярный механизм передачи сигнала через рецепторы
1.4.3. независимый путь
1.4.4. Рецепторы в гемопоэзе.
1.4.5. Лиганды в 1емопоэзе.
1.4.6. Растворимые и иммобилизованные лиганды
1.5. Проблема экспансии стволовых клеток i vi
1.6. Анализ генной экспрессии микроокружения стволовой клетки Глава 2. Материалы и методы
2.1. Методы культуры клеток
2.1.1. Клеточные линии.
2.1.2. Получение популяций гемопоэтических клеток костного
2.1.3. Получение культуры первичной стромы
и прикрепленных клеточных линий из ДККМ мышей,
дефицитных по ФНОа
2.1.4. Дифференцировка миобластов, мезенхимальных
стволовых клеток и первичной культуры стромы костною мозга
2.1.5. Ретровирусные конструкты и супернатанты.
2.1.6. Ретровирусная трансдукция клеток I ЗТЗ и
2.1.7. Совместное культивирование для анализа передачи сигнала через рецепторы
2.1.8. Анализ способности гемопоэтических клеток к колониебразованию
2.1.9. Ретровирусная трансдукция моноядерных костного
2.1 Культивирование моноядерных клеток костного мозга с трансдуцированными ретровирусами
клетками линии I ЗТЗ и 5.
2.1 Окрашивание клеток и анализ.
2.2. Молекулярные методы.
2.2.1. ПЦР амплификация
2.2.2. Полуколичественная ОТ ПЦР.
2.2.3. Саузернблот гибридизация.
2.2.4. Нозернблот гибридизация
2.2.5. Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК.
2.2.6. Экспрессия и очистка белков.
2.2.7. Получение поликлональных антител к i.
2.2.8. Получение амплифицированных библиотек кДНК
из тканей мыши.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1.Структурнофункциональный анализ нового гена i
3.1.1. Клонирование кДНК и анализ первичной структуры белка
3.1.2. Анализ экспрессии i
3.1.3. Выживание колониеобразующих клеток
на монослое фибробластов, экспрессирующих i.
3.1.4. i и передача сигнала через рецепторы .
3.1.5. i и остеобластная дифференцировка
3.2. Изучение экспрессии генов, влияющих на поддержание кроветворения, в клетках стромальных клеточных линий.
3.2.1. Гены адгезии и хоуминга.
3.2.2. Ростовые факторы и цитокины.
3.2.3. Прочие ростовые факторы.
3.3. Влияние экспрессии белка в стромальном подслое на поддержание кроветворных предшественников
в системе кокультивирования i vi
Заключение.
1. Выводы
2. Печатные работы.
Литсрагура.
Основные использованные обозначения и сокращения
дАТФ дезоксиадепозинтрифосфорная кислота
КООБ клетки, образующие область булыжника
ОРС открытая рамка считывания
ОТ I II I обратная транскрипция и ПЦР
ППК подслой прилипающих клеток
ПЦР полимеразная цепная реакция
СКК стволовые клетки крови
vi , эмбриональная бычья сыворотка
I интерлейкин
1 iiii i, фосфатносолевой буфер i ii малая интерферирующая РНК , рецептор клеток
Введение


Произвести анализ экспрессии некоторых ключевых генов, ответственных за самоиоддержание и дифференцировку СКК, в стромальных линиях, полученных из костного мозга мыши. Оценить влияние оверэкспрессии белка 1 в линии фибробластов I на гемопоэз i vi в системе совместного культивирования. Обнаружен новый ген i, экспрессирующийся в ранних кроветворных предшественниках, и показано его участие в регуляции дифференцировки кроветворных предшественников и передаче сигнала через рецепторы . Проведенные исследования позволяют обогатить современные представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе биологии стволовых и прогениторных клеток. Результаты представленной работы открывают перспективы для создания оптимальных условий для i vi культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы. Результаты работы демонстрируют возможность получения клеточных линий, поддерживающих кроветворные предшественники i vi, из клеток, исходно такой активностью не обладающих, с помощью относительно простых генетических манипуляций. Идентифицированный ген i экспрессируется в гемопоэтических клетках с кратковременной репопулирующей активностью и в меньшей степени в клетках с кратковременной репопулирующей активностью. I ЗТЗ негативно влияет на выживание колониеобразующих гемопоэтических миелоидных предшественников в системе кокультивирования клеток i vi. Данный эффект требует непосредственного физического контакта гемопоэтических и стромальных клеток. ДНК i, так и при инкубации клеток с растворимой формой белка. Стабильная экспрессия белка 1. I ЗТЗ приводит к более чем 0кратному увеличению числа миелоидных колониеобразующих клеток при культивировании клеток костного мозга на одном из клеточных клонов, экспрессирующих 1. В то же время, высокий уровень экспрессии 1 в клетках подслоя сам по себе еще недостаточен для возникновения поддерживающей гемопоэз активности. В первую очередь хочу выразить искреннюю благодарность своему научному руководителю, заведующему лабораторией Молекулярной биологии развития Александру Вадимовичу Белявскому, за чуткое руководство и постоянную помощь в освоении методик, проведении исследований, интерпретации полученных данных и оформлении работы всем бывшим и настоящим сотрудникам лаборатории Молекулярной биологии развития за теплую атмосферу, постоянное внимание и поддержку сотрудникам лаборатории Физиологии кроветворения Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук Нине Иосифовне Дризе, Максиму Александровичу Эршлеру, Ирине Николаевне Нифонтовой и Дарье Александровне Свинаревой за плодотворное сотрудничество и помощь в интерпретации и оформлении полученных результатов, а также всем коллегам и сотрудникам Института Молекулярной биологии РАН за постоянную поддержку и помощь на всех этапах работы. Также хочу выразить большую благодарность Центру медицинских исследований Университета Осло за финансовую поддержку научных исследований. Кроветворение представляет собой непрерывный процесс образования зрелых клеток крови, выполняющих многочисленные функции в организме. Клетки крови имеют ограниченное время жизни и не способны к делению, восполняющему их потери. Образование новых зрелых клеток происходит в органах кроветворения в костном мозге, лимфатических узлах, селезенке и тимусе. Образование зрелых клеток из СКК и олигопотентных предшественников сложный многоступенчатый этап последовательных стадий дифференцировки, клеточного деления и апоптоза. Рецепторы, экспрессирующиеся на поверхности кроветворных клеток, осуществляют взаимодействие с их микроокружением, образованным стромальными клетками и внеклеточным матриксом, а также с дистантно действующими растворимыми ростовыми факторами и цитокинами. Ниша стволовой клетки может быть определена как пространственная структура, в которой находятся способные к воспроизведению стволовые клетки. Впервые это понятие было предложено для позвоночных . Xi i, , i . У высших организмов анапиз ниши стволовых клеток осложняется тем, что она имеет довольно размытые морфологические границы.