Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения

• Автор: Рукавцова, Елена Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 253 с. : ил.

Введение

Глава 1. Теоретическое обоснование получения трансгенных

растений с новыми заданными признаками обзор литературы

1.1. Создание растений, устойчивых к насекомымвредителям

1.2. Подавление экспрессии генов в генетической инженерии и биотехнологии растений

1.2.1. Использование антисмысловых РНК для подавления экспрессии генов в растениях.

1.2.2. РНКинтсрференция у растений.

1.2.3. Применение РНКинтерференции в генетической инженерии растений.

1.2.4. Создание растений, устойчивых к фитопатогенам

1.2.5. Изменение пищевых качеств трансгенных растений

1.2.6. Изменение метаболизма в трансгенных растениях.

1.3. Конструирование траисгенных растснийпродуцептов целевых белков
1.3.1. Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях
1.3.2. Экспрессия рекомбинантных антител в трансгеи пых растениях
1.3.3. Синтез субъединичных вакцин в трансгенных растениях
1.4. Получение свободных от дополнительных генетических
маркеров растений
Экспериментальная часть Глава 2. Объекты и методы исследования.
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Растения
2.3. Микробиологические среды
2.4. Среды для культивирования растений и протопластов.
2.5. Реактивы, растворы и ферменты.
2.6. Конструирование плазмид для трансформации растений
2.7. Трансформация растений
2.8. Анализ трансгенных растений.
Глава 3. Создание и анализ трансгенных растений, устойчивых к насекомымвредителям
3.1. Получение и молекулярногенетический анализ трансгенных растений с различными вариантами гена 6.
3.2. Анализ инсектицидной активности полученных трансгенных растений.
3.3. Комбинированное использование регулируемых промоторов и технологии прививок для получения растений, синтезирующих чужеродные белки в определенных органах и тканях.
3.4. Конструирование плазмид с геном Сгу1АЬ, пригодных для трансформации широкого круга хозяев
Глава 4. Подавление экспрессии генов с помощью антисмысловых
РНК и РНКинтерференции
4.1. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы И в протопластах АЧсойапа шЬасит Т. с помощью антисмысловых РНК
4.2. Ингибирование экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы И в трансгенных растениях с помощью двуцепочечных РНК.
4.3. Фенотипические изменения трансгенных растений Мсойапа
гаЬасит Ь., содержащих антисмысловую форму гена
Глава 5. Создание и исследование трансгенных растений МсоНапа Ь., экспрессирующих агробактериальные гены биосинтеза
фитогормонов.
5.1. Физиологобиохимические особенности растений табака,
экспрессирующих агробактериальный ген изопентснилтрансферазы
5.2. Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих агробактериальный ген
триптофанмонооксигеназы i
5.3. Влияние суперпродукции ауксинов и цитокининов на
фотосинтез, рост и развитие трансгенных растений табака
5.4. Подавление экпрессии агробактериальных онкогенов в трансгенных растениях с помощью антисмысловых РНК.
Глава 6. Получение и анализ трансгенных растений,
экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса г епатита В
.
6.1. Создание и молекулярногенетический анализ растений ii ., содержащих н под контролем одинарного и двойного промоторов РНК вируса мозаики цветной капусты
6.2. Получение и анализ растений картофеля i ., содержащих ген под контролем промоторов V и
гена иататина ВЗЗ
6.3. Выделение и характеристика антигена, синтезируемого трансгенными растениями табака и картофеля
6.4. Тканеспецифическая экспрессия тема. в клетках трансгенных растений и культуры тканей ii
6.5. Получение и анализ безмаркерных растений, экспрессирующих
ген поверхностного антигена вируса гепатита В.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Действие токсинов начинается только при их проглатывании вредителем, причем летальный исход наступает через несколько часов или дней, то есть весь процесс занимает больше времени, чем при использовании обычных инсектицидов. В растениях специфические инсектицидные белки синтезируются в растворимой форме. И в том, и в другом случае активные инсектицидные белки проникают через мембрану и связываются со специфическими рецепторами на эпителии среднего кишечника, формируя поры и приводя к потере трансмембранного потенциала, лизису клеток, вытеканию содержимого среднего кишечника, параличу и смерти насекомого . У насекомых с развивающейся устойчивостью к наиболее часто происходит снижение или изменение связывания с рецептором, хотя иногда отмечается изменение в протеолизе токсина . При применении в качестве спрея, препарат относительно нестабилен, может быть смыт дождем или разрушен ультрафиолетом, что вызывает необходимость снова его распылять каждые дня. Эта нестабильность, в сочетании с низкой дозой , остающейся на растениях, могут приводить к развитию устойчивых популяций насекомых. Этих проблем можно избежать, используя iрастения, где накапливаются более высокие и однородные дозы инсектицидных белков. Первые работы по созданию траисгсиных растений, устойчивых к насекомымвредитслям, были опубликованы в году . V . В дальнейшем в растения были введены многие гены В. Немодифицированные токсины плохо экспрессировались в растениях, особенно в полноразмерной форме, поскольку у i iii богатая ДНК, содержащая множество последовательностей, которые воспринимаются растительными клетками как места сплайсинга, сигналы полиадснилирования, терминации транскрипции и сигналы деградации мРНК v . Кроме того, растений другая частота использования кодонов. Таблица 1. Экспрессия генов, кодирующих, инсектицидные белки В. Табак СгуАа . Евстратова и др. К Богдарина и др. М . Сгу2Аа2 . Томат 4 i . Картофель СгуПА . СгуЗАа . V, i . Г ибрид 1 1 iv . Рис i . Хлопок , . Кукуруза i . Баклажан СгуЗВ I . СгуЗВЬ V . Брокколи . Люцерна iv . Канола I . Соя . Рапс ii . Сосна Рпт аеса Ь. Рис, кукуруза , слитый с Вцепыо рицина . В некоторых случаях менее интенсивные изменения в кодирующей последовательности также приводили к повышению экспрессии генов в трансгенных растениях . Однако экспрессия немодифицированного гена i в хлоропластах была очень высокой но сравнению с экспрессией в цитоплазме растительных клеток i . В настоящее время в мире под растения занято более млн га. Большая часть трансгениых растений с токсинами выращивается в США. Общая площадь, занятая под растения выросла в раз с го года когда впервые было разрешено выращивать эти растения и растет с каждым годом. Такой быстрый рост площадей под трансгенными культурами демонстрирует их высокую эффективность и безопасность. В связи с использованием растений существенно снизились масштабы и кратность применения химических инсектицидов . Имеется множество данных, показывающих эффективность использования растений в полевых условиях. Так, показано, что разные линии кукурузы устойчивы к действию гусениц стеблевого мотылька ii ii, и югозападной кукурузной огневки i i . В нолевых экспериментах 0 личинок стеблевого мотылька и хлопковой совки iv погибало на растениях кукурузы с конститутивной экспрессией токсина 1 . Показано, что коммерчески выращиваемый хлопчатник с геном устойчив к хлопковой совке iv i . Трансгениый рис, синтезирующий токсин 1 , в течение всего периода вегетации был устойчив к двум видам огневок . Следует отметить, что экспрессия токсинов защищает трансгенные растения от вредителей не только в период вегетации, но и при хранении урожая. Показано, что зерна кукурузы с генами и Сгу9С хорошо защищены от амбарной огневки i i и зерновой моли i i . За счет этого повышается безопасность хранения урожая кукурузы, поскольку при этом не используются химические инсектициды. Оказалось, что зерна трансгенной кукурузы хорошо защищены также от действия фитопатогенных грибов, особенно i, опасных для здоровья человека и животных. Возможная причина такой защиты в том, что початки кукурузы слабо поражаются насекомыми, способствующими инфицированию тканей зерна патогенными грибами vi, .