Механизм локализации мРНК нового гена Germes в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis

• Автор: Пономарев, Максим Борисович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 86 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биологическая роль локализованных РНК

Локализующиеся РНК как детерминанты развития

i
X
Асцидии
i i
Роль локализующихся РНК в специализации клеток половой линии Формирование зародышевой плазмы у i
Формирование зародышевой плазмы у X
Зародышевая плазма у других организмов
Механизмы локализации РНК в клетке
Свободная диффузия и локальное заякорнвание
Локализация РНК с помощью деградации
Активный транспорт
i
X
Активный транспорт в соматических клетках
Регуляция транспорта и локализации РНК
Цисдействующие последовательности
Трансдействующие факторы


Регуляция трансляции локализующихся мРНК
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение зародышевого материала лягушки
Анализ пространственной и временной экспрессии транскриптов, соответствующих кДНК фрагментам, с помощью метода обратной транскрипции РНК и ПЦР амплификации
Клонирование полноразмерной кДНК
Получение 3 области кДНК с помощью 3 I
Получение 5 области кДНК с помощью 5 СЕ
Клонирование полноразмерной кДНК с помощью Приготовление ДНК конструктов для синтеза РНК
Микроинъекции
Получение ооцитов для микроинъекций
Синтез флуоресцентной РНК
Получение конфокального изображения живых ооцитов инъецированных флуоресцентной РНК
Метод сшивки с помощью ультрафиолета
Получение белкового экстракта из ооцитов
Синтез радиоактивно меченой РНК
Связывание белковых факторов с РНК
Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК
Электрофорез в агарозном геле
Рестрикция
Зачистка концов фрагментом Кленова
Дефосфорилирование
Лигирование
Трансформация компетентных клеток
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация и клонирование кДНК нового гена, транскрнпт которого локализован на вегетативном полюсе ооцитов и ранних эмбрионов X vi
Исследование механизма локализации мРНК на вегетативный полюс ооцита
Поиск цисдействующих последовательностей мРНК
Исследование белковых факторов, взаимодействующих с ЗНТО мРНК
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Это явление обнаружено во многих типах клеток различных живых систем от бактерий и дрожжей до растений и животных. Неравномерно распределенные РНК локализуются в специфических областях клетки, где принимают участие в различных биологических процессах, таких как локальная регуляция трансляции и сборка новых функциональных белковых комплексов, подвижность клетки и поддержание ее морфологии, полярность, асимметричное деление, синаптическая пластичность. Особенное значение этому явлению придается в биологии развития. Локализованные в ооцитах и эмбрионах РНК, часто функционируют как детерминанты развития, играя важную роль при формировании полярности и осей развития зародыша, детерминации и дифференцировки различных типов клеток и тканей. Одной из главных задач локализующихся РНК является обеспечение белковой экспрессии транскрипта в специфической области клетки. Тот же результат может быт ь достигнут за счет локализации непосредственно самого белкового продукта РНК, однако именно процесс локализации РНК является наиболее распространенным, экономичным и эффективным способом доставки белкового продукта транскрипта в специфическую область клетки. Для осуществления своих функции локализующиеся РНК должны быть своевременно и правильно доставлены в специфическую область клетки. С этой целью в клетках действуют различные механизмы локализации цитоплазматических РНК, описывающихся тремя основными моделями 1 свободная диффузия РНК и ее захват в специфической области клетки 2 свободная диффузия РНК и ее локальная защита от деградации 3 активный транспорт РНК вдоль компонентов цитоскелетной сети. В основе механизмов локализации РНК лежит взаимодействие между цисдействующими последовательностями РНК, являющимися ее сигналами локализации, и трансдействующими белковыми факторами, составляющими молекулярную основу локализационной машины. Однако то, какие принципы заложены в основе организации сигналов локализации РНК, какие белковые факторы их узнают, и каким образом обеспечивается специфичность этого взаимодействия, остается во многом неизвестным. Исследование вопроса, при участии каких дополнительных факторовмоторов происходит транспорт РНК, и что его регулирует, является необходимым для полного понимания функционирования механизмов локализации РНК. РНК и трансдействующих белковых факторов остается актуальной задачей. В настоящей работе исследуется механизм локализации мРНК нового гена в оогенезе шпорцевой лягушки X Ivi и цис и транс действующие факторы, принимающие участие в регуляции транспорта транскрипта. Локализующиеся РНК впервые были открыты и исследованы в таких клетках как дрожжи и фибробласты. Локализуясь в специфических областях клетки, эти РНК играют важную биологическую роль. Так, при асимметричном клеточном делении дрожжей, мРНК гена рис. А локализуется в дочернюю клетку, что приводит к переключению типа спаривания в ней . i . В эмбриональных фибробластах курицы мРНК Б ii . i, . Локализующиеся РНК были обнаружены также и в других соматических клетках, таких как миобласты i . . i . . В см. Например, локализующиеся мРНК генов Таи и МАР2 играют важную роль в поддержании поляризованного состояния развивающихся нейронов . В то время как мРНК Таи локализуется в проксимальную область аксонов, мРНК МАР2 исключается из аксонов и накапливается в дендритах . i . i . Белки, кодируемые этими мРНК, связываются с микротрубочками и стабилизируют их, что определяет различия в организации цитоскелета в аксонах и дендритах. Ряд локализующихся в нейронах РНК принимают участие в синоптической пластичности. Среди них, например, мРНК генов асубъединицы кальцийкальмодулин киназы II II, , МАР2, , асубъеднннцы рецептора глицина . i . i . i . . Неравномерно распределенные РНК были также обнаружены в ооцитах и эмбрионах многих животных.