Регуляция активности цитохромов Р450 2В и 1А и экспрессии их генов

• Автор: Гуляева, Людмила Федоровна
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 209 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современная классификация генов цитохрома Р

1.2. Типы индукторов цитохрома Р

1.3. Активность и ипдуцибелыюсть цитохромов Р0 в онтогенезе

1.3.1. Общие аспекты развития монооксигеназной системы печени животных и человека

1.3.2. Развитие активностей цитохрома Р0 в эмбриональный период

1.3.3. Развитие микроеомных монооксигеназ печени у животных

раннего неонатального периода

1.3.4. Регуляция активности СУР в эмбриональный и неонатальный периоды жизни

1.3.5. Множественные формы цитохрома Р0 в разные периоды

развития. Неонатальный импринтинг
1.4. Тканеспецифичность индукции цитохромов Р0.
1.5. Характеристика цитохромов Р0 подсемейства 1А
1.5.1. Индукция цитохрома Р0 1А1.
1.5.2. Индукция цитохрома Р0 1А2.
1.6. Активация генов подсемейства СУР2В барбитуратами и другими соединениями.
1.6.1.Характеристика цитохромов подсемейства Р0 2В.
1.6.2. Механизм индукции СУР2В барбитуратами.
1.7. Генетический полиморфизм цитохромов Р0 и химический канцерогенез.
1.7.1. Полиморфизм СУР человека
1.7.2. Межлинейные различия в активности цитохрома Р0 у лабораторных животных
1.8. Цитохром Р0 в метаболизме эндогенных соединений.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1 Материалы
2.2. Плазмиды
2.3. Животные
2.4. Обработка животных индукторами
2.5. Выделение микросом
2.6. Определение белка.
2.7. Определение количества цитохромов Р0 и Ь.
2.8. Определение активности НАДФНцитохром Р0 редуктазы
2.9. Определение каталитической активности форм СУР
2.9.1 Гидроксилирование БП.
2.9.2. Одеалкилирование этоксирезоруфинов.
2.9.3. деметилирование беизфетамина
2.9.4. Метаболизм алдрииа
2.9.5. Метаболизм андростендиона.
2 Иммунохимические методы.
.Получение антител.
. Ракетный иммуноэлектрофорез
. Ингибирование метаболизма различных субстратов антителами
2 Получение очищенных препаратов цитохрома Р0.
2 Очистка НАДФНцитохром Р0 редуктазы.
2 гелъ электрофорез и иммупоблотипг белков микросом
2 Приготовление радиоактивных зондов
2 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
2 Получение двухцепочечных фрагментов ДНК из олигонуклеотидов.
2 Выделение суммарной РНК из клеток печени
2 Электрофорез РНК и ДНК
2 Гибридизация РНК
2 Полимеразная цепная реакция.
2 Выделение белковых ядерных экстрактов.
2 Анализ ДНКбелковых комплексов методом задержки ДНК в геле
. Инкубации олигопуклеотидов с белками ядерных экстрактов из печени крыс, индуцированных ксенобиотиками.
. Инкубация олигонуклеотидов с белками ядерных экстрактов из печени контрольных крыс при добавлении индукторов в условиях i
2 Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Идентификация молекулярных форм цитохрома Р0, изолированных
из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом и 3мет илхолантрен ом
3.2. Оценка каталитической активности множественных форм цитохрома Р0 в микросомах печени крыс по метаболизму
андростендиона
3. 3. Активность цитохромов РА и 2В в печени новорожденных крыс
3.3.1. Характеристика форм , индуцированных в печени неонатальных крыс.
3.3.2. Иммунохимическое определение индуцированных форм .
3.3.3. Метаболизм специфических субстратов МОС печени крыс
раннего неонатального периода.
3.3.4. Каталитическая активность индуцированных форм у новорожденных крыс
3.4. Исследование экспрессии генов цитохромов РА в печени и легких
крыс, индуцированных различными ксенобиотиками
3. 5, Характеристика печени мышей различных линий.
3.6. Мелслинейныеразличия в ферментативной активности и экспрессии его гена в печени крыс при индукции фенобарбиталом и трифепилдиоксаном.
3.7. Регуляция экспрессии гена 2 индукторами ФБтипа
3.7.1. Исследование активности цитохрома РВ1 и экспрессии его
гена при индукции ФБ и ТФД.
3.7.2. Исследование взаимодействия позитивного и негативного цисактивных элементов гена с идернмми белками печени крыс в разное время после введения им индукторов.
3.7.3. Исследование взаимодействия позитивного и негативного цисактивных элементов гена с ядерпыми белками печени крыс
при добавлении индукторов в системе i vi.
3.8. Альтернативный сплайсинг мРНК цитохрома Р0 2В2 в печени крыс
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Таким образом, основная функциональная роль микросомной монооксигеназиой системы состоит в метаболизме чужеродных соединений, попадающих в организм из окружающей среды. Лишь после того, как эти соединения окислятся в более полярные, они могут быть удалены из организма. Существует целая система регуляции скоростей этих реакций, а, следовательно, и эффективности детоксикации. В качестве регуляторов активности монооксигеназ выступают прежде всего сами ксенобиотики, способные индуцировать ферментную систему, участвующую в их метаболизме Соппеу, . Р0, различающиеся но субстратной специфичности Мишин, Ляхович, , , . Существование множественных форм цитохрома Р0 в настоящее время доказано их выделением из микросомной мембраны i i. В последнее время через каждые три года появляется обзорная статья, классифицирующая все известные на данный момент цитохромы Р0 . Безусловно, феномен множественности молекулярных форм цитохрома Р0 объясняет гибкость микросомной монооксигеназной системы, способной метаболизировать самые разнообразные химические соединения. Кроме того, активность монооксигеназ зависит от типа ткани, где избирательно индуцируются их молекулярные формы i . Следует заметить, что механизмы тканеспецифичной экспрессии генов цитохрома Р0 к настоящему времени остаются неизвестными. Многие физиологические факторы, такие как возраст . Iii . Участие в метаболизме таких эндогенных соединений, как стероидные гормоны, холестерин, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты другая функция микросомальной монооксигеназной системы. Метелица, , т. Р0 участвует в реакциях биосинтеза кортикостероидов из холестерина. Эти реакции происходят в микросомах и митохондриях коры надпочечников. Помимо анаболических реакций, цитохромы Р0 участвуют в катаболизме стероидных гормонов, в том числе половых, регулируя таким образом их физиологический уровень . Многие эндогенные соединения, такие как витамин 3, могут выполнять свои физиологические функции лишь после активации цитохромом Р0 i . Некоторые формы цитохрома Р0, синтезируемые главным образом в микросомах почек, участвуют в метаболизме простагландинов . На первом Международном совещании в г. Эрлае США, Гены Р0 и их регуляция был создан комитет по стандартизации номенклатуры генов Р0. В году появился первый обзор, посвященный эволюции и номенклатуре генов суперсемейства Р0 . В годах с помощью компьютерного анализа было построено филогенетическое дерево суперсемейства цитохрома Р0, состоящего из 7 последовательностей кДНК и ДНКгеномных клонов Р0 . К концу года было идентифицировано семейства цитохрома Р0 1 ген, принадлежащих видам эукариот и видам прокариот . В настоящее время суперсемейство цитохромов Р0 включает в себя, по крайней мере, различных генных семейств, из которых обнаружены у млекопитающих . Р0 2В1. Изначально ксенобиотики индукторы монооксигеназ разделяли на два типа Соппеу, индукторы ФБтипа куда относятся органические растворители, пестициды, хлорированные бифенилы и лекарства и МХтипа полициклические ароматические углеводороды ПАУ, 3метилхолантрен X, полихлорированные бифенилы, диоксины Соппеу, Мишин, Ляхович, . Картина индукции цитохромов Р0 при введении животным ФБ или X существенно различается. У крыс введение ФБ индуцирует преимущественно и , а X активирует экспрессию генов 1 обычно ПАУ индуцируют оба цитохрома и , хотя есть и исключения. Мощным селективным индуктором является 2,3,7,8тетрахлордибензордиоксин, индуцируется преимущественно изосафролом V, , ii . Известны и другие тины индукторов. Так, органические растворители, такие как ацетон и этанол, индуцируют дексаметазон и прегненолон 1 бехкарбонитрил 3 пероксисомальные пролифераторы, например, клофибрат 4 , . Полигалогенированныс бифенилы, в зависимости от количества атомов галогена и их положения в молекуле, подобно ФБ, индуцируют 2 или, как ПАУ, 1. Коммерческие смеси этих соединений являются индукторами смешанного типа, то есть индуцируют подсемейства 2В и 1А Цырлов, i . Интересно, что индукторами 2 у грызунов являются многие хлорсодержащие пестициды такие, как ДДТ, кепон, метоксихлор .