Никующая эндонуклеаза N.BspD6I : определение пространственной структуры и применение для гибридизационного анализа

• Автор: Рогулин, Евгений Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 133 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общее представление о системах рестрикциимодификации

1.2. Разнообразие эндонуклеаз рестрикции типа

1.3. Взаимодействие эндонуклеаз типа II с узнаваемой последовательностью

1.4. Пространственная структура эндонуклеаз рестрикции типа II

1.5. Биологическая роль систем рестрикциимодификации

1.6. Никующие эндонуклеазы

1.6.1. Искусственные никазы

Получение никаз с нарушенным димеризационньт интерфейсом Получение никаз путем инактивации одного из каталитически сайтов

НиковапиеДНК с использованием пептидных олигонуклеотидов

1.6.2. Практическое применение сайтспецифичсских никаз

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
3.2. Методы
Рассчет значений индекса кодонового соответствии Выделение плазмидной ДНК из .i ПЦРамплификация Очистка ДНК на ii
Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М шнипреп
Выделение двухцепочечной формы ДНК фага на основе М максипреп
Выделение одноцепочечной формы ДНК фага на основе М Скрининг рекомбинантных клопов при помощи ПЦР с колоний Электрофорез белков в ПААГ Получение компетентных клеток .i Трансформация компетентных клеток .i
Индукция экспрессии генов в клетках . i Получение фага ХСЕб Определение титра фага
Проверка способности фага ХСЕб активировать транскрипцию с промотора фага Т
Получение клеток , не чувствительных к присутствию метилаз
Выделение никазы .I
Определение активности никазы Метод анализ а
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение супериродудента никазы
3.1.1. Получение продуцента никазы на основе клеток . i ТОР
3.1.2. Определение влияния кодонового состава на уровень экспрессии
ИЗ
ЗЛ.З.Создание генетической конструкции, несущей одновременно гены редких транспортных РНК и ДНКметилтрансферазы 8зсЫ1 3.1.4. Конструирование продуцента никазы на основе клеток Е.соН ВЬОЕЗ
3.2. Выделение никазы
3.3. Определение пространственной структуры никазы
3.3.1. Кристаллизация никазы
3.3.2. Определение пространственной структуры никазы
3.4. Анализ пространственной структуры никазы
3.4.1. Субдомен Чконцевого домена никазы
3.4.2. Субдомен 2 Иконцевого домена никазы
3.4.3. Лиикерный домен
3.4.4. Сконцсвой домен
3.4.5. Каталитический центр никазы
3.4.6. Моделирование комплекса никазы с ДНК
3.5. Метод детекции нуклеиновых кислот с помощью молекулярных биконов и никазы
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. Список публикаций по материалам диссертационной работы 8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Подобный эффект был позже обнаружен и при размножении фага Т1 в бактерии i i x . Суть этого явления заключался в том, что при пересеве фага из одного штамма в другой наблюдалось резкое снижение эффективности инфекции, однако после первого цикла размножения инфекционность бактериофага восстанавливалась. В году Арбером с сотрудниками была предложена модель, согласно которой ограничение осуществляется эндонуклеазами, которые расщепляют молекулы ДНК, не защищенные специфической модификацией . Модификацию производит метилтрансфераза, которая метилирует основания ДНК аденин или цитозин. От английского слова ii ограничение эндонуклеазы рестрикции получили сво название. В конце шестидесятых годов прошлого века из . Это послужило толчком к развитию молекулярной биологии, так как эндонуклеазы рестрикции стали использоваться при создании рекомбинантных молекул ДНК i , , , , ii , . В настоящее время сайтспецифические эндонуклеазы рестрикции Иго типа являются одним из основных инструментов при
манипуляциях с молекулами ДНК. Системы рестрикциимодификации очень распространены у бактерий. Среди трех десятков бактериальных геномов, секвенированых на сегодняшний день, содержат системы рестрикциимодификации, а около из них имеют более одной системы. Больше всего систем рестрикциимодификации обнаружено у i i этот штамм содержит системы , . Большое разнообразие систем рестрикциимодификации вызвало необходимость их классификации. Классификация систем РМ основана на сходстве или различии в молекулярной организации ферментов, необходимых кофакторах реакции, симметрии узнаваемой последовательности и положении точек расщепления ДНК а, . В настоящее время выделяют три основных типа систем рестрикциимодификации 1, II и III Рис. Рис. Обобщенная схема строения систем рестрикциимодификации типов I, II. Я эндонуклеаза рестрикции, М ДНКметилтрансфераза, Б узнающая субъединица. IV входят в систему типа II. I представляют собой мультимерные коммплсксы кДа, образованные тремя типами субъединиц , ЬЫЯ и в соотношении 1ЫМ 1ЫЯг . Субъединица 1ЫМ обладает метилазной активностью, 1ЫЯ эндонуклеазной, а ЬЫБ ответственна за узнавание сайта например, сайт ЕсоВ ТСА8ЫТССТ. МГ. АТФ. Расщепление ДНК происходит на расстоянии от н. Согласно одной из моделей расщепления i , , каждый из комплексов, связавшийся с сайтом, сначала протягивает через себя ДНК, вызывая ее суперспирализацию транслокация ДНК, а затем, когда два комплекса столкнутся, происходит расщепление ДНК Рис. Согласно другой модели, основанной на данных атомносиловой микроскопии i , , . АТФ. При добавлении АТФ начинается транслокация ДНК, петли, образовавшиеся при димеризации ДНК, постепенно укорачиваются и, когда дальнейшая транслокация становится невозможной, происходит расщепление ДНК Рис. Рис. Схематическое представление транслокации ДНК а согласно модели i согласно данным атомносиловой микроскопии i . Системы типа III также мультимерные комплексы 0 кДа, образованные двумя типами субъединиц и в соотношении . Субъединица ответственна за узнавание сайта и метилирование остатка аденина в сайте. В присутствии только изолированная субъединица функционирует как метилаза. Субъединица обладает эндонуклеазной активностью, которая проявляется только в комплексе . Комплекс узнает несимметричную последовательность например, I и для расщепления ДНК, как и в случае систем типа I, требуется , 2 и АТФ, а также взаимодействие комплексов, связанных с двумя сайтами. Однако в отличие от систем типа I, расщепление ДНК происходит вблизи от одного из сайтов на фиксированном расстоянии от сайта. Так, ЕсоР1 расщепляет ДНК на расстоянии нуклеотидов от сайта по верхней цепи, и по нижней цепи i , . Интересно, что АТФ необходима ферментам Шго типа не только для транслокации ДНК. В присутствии АТФ значительно повышается специфичность узнавания сайта i . АТФ непосредственно для гидролиза ДИК , , i . Присутствие АТФ значительно меняет конформацию фермента и харакгер его взаимодействия с ДНК i . Подавляющее большинство известных в настоящее время систем рестрикциимодификации относится к типу II.