Изучение видоспецифичных ингибиторов бактериальной РНК-полимеразы

• Автор: Юзенкова, Юлия Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 163 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы. Взаимодействие регуляторных факторов с РНКполимеразой.

1.1. Введение.

1.2. Ингибиторы РНКполимеразы. Антибиотики.

1.2.1. Рифампицин.

1.2.2. Тагетитоксин

1.2.3. Альфааманитин

1.2.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина

1.2.5. Стрептолидигин.

1.2.6. Липиармицин

1.2.7. Микроцин
1.2.8. Ингибиторы серии 3.
1.2.9. Дауномицин и марселломицин
1.3. Фаговые транскрипционные факторы, модифицирующие бактериальные РНКполимеразы.
1.3.1. Регуляция транскрипции в ходе развития бактериофага Т
1.3.2. Регуляция транскрипции бактериофага
1.3.3. Регуляция транскрипции в процессе развития фага Т
1.3.4. Транскрипция фага
1.3.5. белок фага НК2
1.3.6. Белок бактериофага 4.
1.3.7. Белок р4 фага9
1.3.8. Белок фага Р2.
1.4. Клеточные регуляторы транскрипции.
1.4.1. Белковые репрессоры и активаторы инициации транскрипции.
1.4.2. Небелковые регуляторы транскрипции
1.4.3. Топоизомеразы.
1.4.4. Рибосомные белки, участвующие в транскрипции.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги
2.2. Бактериальные среды
2.3. Полимеразы
2.4. Приготовление лизата фага Хр.
2.5. Электрофорез
2.6. Компетентные клетки и трансформация бактерий.
2.7. Приготовление ДНК.
2.8. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.9. Экспрессия субъединиц РНКполимеразы, частей субъедиинцы РНКполимеразы . i и X. и белка р7
2 Выделение тел включения гиперпродуцированных субъединиц, частей субъединицы РНКполимеразы . i и X. и белка р
2 Очистка белков из тел включения хроматографией на i агарозе в денатурирующих условиях.
2 Сборка РНКполимеразы . i из отдельных субъединиц i vi.
2 Приготовлеиие РНКполимеразы из клеток
2 Частичная очистка РНКполимераз содержащих субъединицу плазмидного происхождения
2 Транскрипция i vi.
в
2 Пирофосфоролиз
2 Получение арестованных в положении элонгационных комплексов.
2 Щелочное расщепление транскрипта
2 Коиммобилизация РНКполимеразы X. и р7 на i агарозе
2 Эксперименты по замедлению миграции промоторных фрагментов в нативном ПААГ
2 Разделение белковых комплексов в нативном ПААГ.
2 Тестирование трансформантов на устойчивость к микроцину i viv.
2 Сайтспецифический мутагенез клонированного гена .i.
2 Мечение олигонуклеотидов
2 КМ1Ю4 футпринтинг.
2 Расщепление термолизином микроцина5.
2 Обратнофазная НРЬС хроматография микроцина и его производных
2 Мечение белка р
2 Блотгинг и гибридизация.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Изучение молекулярного механизма ингибирования РНКполимеразы ХапОютопая огутае белком р7 бактериофага ХрЮ
3.1.1. Р7 не является антисигма фактором.
3.1.2. Р7 взаимодействует с Ыконцевым участком рсубъединицы
3.1.3. Р7 препятствует образованию открытого комплекса РНКполимеразой Х.огугае.
3.1.4.р7 подавляет терминацию транскрипции РНКполимеразой Х.уае. .
3.1.5. р7 способствует заплетанию дуплекса ДНК позади транскрибирующей полимеразы.
3.1.6. Р7 участвует в регуляции транскрипции генома фага ХрЮ
3.2. Изучение молекулярного механизма ингибирования РНКполимеразы микроцином 5.
3.2.1. Открытие и свойства микроцина 5.
3.2.2. Система отбора устойчивых мутантов. .
3.2.3. Дополнительные мутации устойчивости в консервативном сегменте в.
3.2.4. Микроцин .5 специфически подавляет активность РНКполимераз грамотрицательных бактерий
3.2.5. Эффект мутаций внутри и вокруг консервативного района в на устойчивость к микроцину 5
3.2.6. Замены, приводящие к устойчивости к микроцину, есть и в сегменте Г. . .
3.2.7. Некоторые мутации устойчивости к стрептолидигину в р субъединице оказались мутациями устойчивости и к микроцину.
3.2.8. Микроцин ингибирует присоединение нуклеотида по смешанному типу.
3.2.9. Микроцин уменьшает скорость элонгации транскрипции
3.2.9. Микроцин уменьшает скорость пирофосфоролиза.
3.2 Микроцин замедляет впадение тройного элонгационного комплекса в арестованное состояние.
3.2 Микроцин подавляет стимулируемое фактором расщепление транскрипта и не влияет на собственную эндонуклеазную активность РНКполимеразы.
3.2Изученис структуры микроцина
Выводы.
Список сокращений.
Список литературы


В ранних работах был получен ряд данных, позволяющих предполагать, что дискретные i кластеры в нативном ферменте объединены в единую структуру, действующую как функциональная единица РНКполимеразы i , vi . Рифампицин практически не влияет на связывание полимеразы с промотором и на образование открытого комплекса с промотором i . Рифамшпщн полностью подавляет синтез второй фосфодиэфирной связи если синтез инициирован с трифосфата или третьей фосфодиэфирной связи если синтез инициирован с ди или монофосфата , . Следовательно, рифампицин не влияет ни на каталитическую активность фермента, ни на его способность к транслокации. Рифампицин не действует на элонгирующую РНКполимеразу, уже синтезировавшую длинный транскрипт , . Сайт связывания рифампицина формируется только в корферменте, и Рсубъединица играет важную роль в формировании сайта связывания рифампицина, поскольку ни отдельная рсубъединица, ни комплекс агр не связывают рифампицин i . В трехмерной модели структуры РНКполимеразы мутации устойчивости к рифампицину картируются в основании и между долями, которые образует Рчелюсть. Самый близкий к концу кластер мутаций устойчивости положение 6 у . Сконцу кластер положение 7 i находятся там, где эти доли соединяются. Аминокислоты кластера I расположены в обеих долях, аминокислоты кластера II только в одной доле i . Все эти генетические и биохимические данные позволили еще до определения кристаллической структуры комплекса рифампицина с полимеразой примерно определить сайт связывания и выдвинуть гипотезу о механизме действия рифампицина, согласно которой он препятствует выходу РНК. Этот эффект может быть прямым рифампицин стерически блокирует путь выхода транскрипта, либо непрямым рифампицин так меняет конформацию фермента, что РНК не может выходить. Получение кристаллической структуры комплекса РНКполимеразы с рифампицином с разрешением 3,3 . РНК. Рифампицин связывается в кармане Рсубъединицы, глубоко в РНКДНК канале, на расстоянии А от активного центра, то есть слишком далеко дня того, чтобы непосредственно влиять на катализ. Рис. А. Объемная модель комплекса РНКнолимеразы Т. У розовым, ассрым, ион Му2 в каталитическом центре фиолетовым. Атомы рифамницина изображены в виде сфер Соранжевых, Окрасных, голубых. В. Механизм нгибирования рифампицином активности РНКполимсразы. Собственно РНКполимераза не показана. На рисунке приведена модель структуры элонгационного комплекса, где ион в каталитическом центре выделен фиолетовым, входящий субстрат в 1 сайте зеленым, матричная цепь ДНК серым, нуклеотиды в позициях 1 и 2, на которые не влияет связанный рифампицин желтым. Нуклеотиды в положениях РНК от 3 до 8. Атомы рифамницина изображены гак же, как в части рисунка А. По СатрЬе е а. На рис. РНКДНК гибрида и рифампицина в активном центре РНКполимеразы. Рифампицин связывается в основании петли, включающей Сконцевую часть района , к нему примыкает рифампициновый кластер I. По принятой на сегодняшний день структурнофункциональной модели РНКполимеразы, эта петля участвует в формировании Iсайта фермента v . Наглядно показано, что когда транскрипт достигает длины в 3 нуклеотида, 5фосфат сталкивается с рифампицином. Присутствие рифампицина и 4го5го нуклеотидов уже взаимно исключены. Таким образом, все данные свидетельствуют в пользу модели, в которой рифампицин блокирует выход транскрипта, связываясь непосредственно у места выхода. Чтобы измерить расстояние между сайтом связывания рифампицина и сайтом связывания инициирующего нуклеотида использовались химерные реагенты, в которых рифампицин был ковалентно связан с нуклеотидом через углеводородный линкер v . Изучались i и . РНКполимеразы. Исходя из предположения, что при определенной длине линкера оба лиганда займут свои естественные сайты и такой комплекс будет более активен по сравнению с другими. Варьируя количество метиленовых групп, искали комплекс, обладающий максимальной активностью в инициации транскрипции. Оптимальной и для . Тагетитокснн. Тагетитоксин бактериальный фитотоксин рис. З , продуцируемый i v.