Изучение роли теломеразы в реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов

• Автор: Казимирчук, Екатерина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Теломеры и теломераза

1. Структура тсломср.

1.1. Теломерная ДНК.

1.2. Белки, связанные с теломерной ДНК.

1.3. Структура теломер.

2. Функции теломер.

2.1. Защита от хромосомных слияний .

2.2. Эффект положения.

2.3. Структурная функция.

3. Недорепликация, недорепарация.
3.1. Концевая недорепликация.
3.2. Подтверждение укорачивания теломер.
3.3. Проблемы репарации.
4. Компенсация недоренликации.
4.1. Открытие теломеразы, реконструкция теломеразной активности в соматических клетках.
4.2. Структура теломеразы и механизм действия.
4.3 Регуляция теломеразной активности в соматических клетках
млекопитающих.
4.4. Альтернативное удлинение теломер.
5. Иммортализация клеток.
5.1. Иммортализация клеток человека, М1 М2 гипотеза.
5.2 Особенности иммортализации клеток мыши.
6. Подавление теломеразной активности в опухолевых клетках.
6.1. Использование антисмысловых олигонуклеотидов.
6.2. Использование терминирующих аналогов нуклеозидов.
6.3. Стабилизация Оквадруплексов.
6.4. Исследование низкомолекулярных ингибиторов теломеразы.
6.5. Введение в клетки мутантных форм и .
6.6.одавление теломеразы как метод лечения опухолей.
II. Регуляция синтеза ДНК в гетерокарионах.
1. Ранние исследования гетерокарионов.
2. Негативная регуляция синтеза Д1I в гетерокарионах.
3. Гетерокарионы различных делящихся клеток с макрофагами.
III. Регуляция клеточного цикла.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Клетки
2. Условия культивирования клеток.
3. Макрофаги.
4. Получение гетерокарионов.
5. Идентификация продуктов слияния.
6. Приготовление радиоавтографнческих препаратов.
7. Математическая обработка.
8. Подавление функции теломеразы в гетерокарионах.
9. Трансфекция метилРНК олигонуклеотидов в гетерокарионы.
. Изучение длин теломер.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Синтез ДНК в гетерокарионах макрофаг ЗТЗ i в присутствии
азидотимидина.
2. Синтез ДНК в гетерокарионах макрофаг ДФЧ.
3. Изучение пролиферативного потенциала миобластов человека,
экспрессирующих ген .
4. Синтез ДНК в гетерокарионах макрофаг миобласт человека.
5. Синтез ДИК в гетерокарионах макрофаг клетка 7,
трансфицированных антисмысловым олигонуклеотидом к .
6. Синтез ДИК в гетерокарионах макрофаг клетка ЗТЗ i,
трансфицированных антисмысловым олигонуклеотидом к .
7. Изучение влияния ингибиторов теломеразы нового типа на синтез
ДИК в гетерокарионах макрофаг ЗТЗ i.
8. Синтез ДНК в гетерокарионах со стимулированными
макрофагами мыши.
9. Влияние трипсиновой обработки макрофагов на синтез Д1I
в гетерокарионах макрофаг клетка ЗТЗ i.
. Сравнительный анализ длин теломер макрофагов и эмбриональных фибробластов мышей СВА.
ОБСУЖДЕНИЕ
1. аличие теломеразной активности в бессмертных клетках обусловливает реактивацию синтеза Д1I в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов.
1.1 Блокирование теломеразы в гетерокарионах с помощью .
1.2 Теломеризованные клетки человека реактивируют синтез ДНК в макрофагах мыши в гетерокарионах макрофаг ДФЧ,ТЕЯТ и макрофаг миобластI1.
1.3. Введение антисмысловых олигонуклеотидов к снижает индекс реактивации макрофагов в гетерокарионах.
2. Взаимосвязь между неделящимся состоянием макрофагов и репрессией теломеразы в них.
3. Гетерокарионы с макрофагами как тестсистема для изучения ингибиторов теломеразы.
ВЫВОДЫ БЛАГОДАРНОСТИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
УП удвоения популяции.
азидотимидин 3 азидоЗдезокситимидин.
НТК РНКкомпонент теломеразы человека.
ЬТЕКТ каталитический компонент теломеразы человека.
ТАК теломеразная активность.
ДНТФ динуклеозидтс графосфонат.
ЭФМ эмбриональные фибробласты мыши.
ДФЧ диплоидные фибробласты человека.
СОК циклинзависимая киназа.
со ингибитор циклинзависимых киназ.
Введение


Происходит постоянный поиск методов эффективного лечения опухолей. Традиционно в терапии рака используют хирургическое удаление опухолей, облучение и химиотерапию. Этот подход, возможно в комплексе с другими методами, имеет хорошие перспективы, так как теломераза необходима для бесконечной пролиферации раковых клеток, и подавление теломеразной активности должно вызывать остановку пролиферации раковых клеток. Ингибиторы теломеразы могут быть использованы в качестве химиотерапевтических препаратов. Продолжается поиск новых специфичных и эффективных ингибиторов теломеразы. Для анализа свойств ингибиторов теломеразы необходимо наличие адекватных модельных систем. Используемый в настоящее время метод анализа ингибиторов теломеразы, когда клетки с теломеразной активностью инкубируют в присутствии ингибитора, контролируя длину теломер и выживаемость клеток, имеет несколько недостатков требуется много времени для получения результатов, а также необходимы большие количества ингибиторов, что не всегда доступно. Актуальным направлением является разработка других модельных систем для анализа ингибиторов теломеразы. В данной работе проведено исследование влияния подавления функции теломеразы на реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в гетерокарионах. В том случае, если реактивация синтеза ДНК в ядрах макрофагов происходит в ответ на появление теломеразной активности в гетерокарионах, и подавление теломеразной активности ведет к снижению доли гетерокарионов, в которых произошла реактивация, гетерокариоиы с макрофагами можно рассматривать в качестве модели для проверки ингибиторов теломеразы. В диссертационной работе изучается возможность использования гетерокарионов с макрофагами в качестве тестсистемы для анализа новых ингибиторов теломеразы. Следует заметить, что поскольку теломераза является обратной транскриптазой, тестсистема с макрофагами может быть использована для исследования ингибиторов обратных транскриптаз некоторых вирусов, например, вируса иммунодефицита человека. Ранее было показано, что азидотимидин, являясь ингибитором обратной транскриптазы вируса IV, также подавляет и теломеразную активность. Структура теломер. Теломерная ДНК. Теломеры это особые структуры, локализованные на концах всех эукариотических хромосом и важные для генетической стабильности , i, . Теломеры являются комплексом теломерной ДНК и связанных с теломерной ДНК белков , i, . Теломерная ДНК состоит из коротких тандемно повторяющихся последовательностей длиной оснований. Теломерная последовательность ДНК всех позвоночных животных , повторенная сотни и тысячи раз Меупе . Теломерный повтор оказался очень консервативным в эволюции. Так, у организмов, относящихся к разным классам, теломерные повторы могут быть одинаковым или отличаться незначительно табл. В клетках различных организмов длина теломерного повтора варьирует в широком диапазоне от т. Экспериментально длину теломер определяют с помощью гибридизации по Саузерну. Этот метод позволяет определить длину концевых фрагментов рестрикции от англ, i ii . Таким образом, длина , определяемая с помощью гибридизации по Саузерну, оказывается несколько больше реальной длины теломер. Гак как одна цепь ДНК тсломериого повтора содержит примерно остатков гуанозина. НК и комплементарную ей Сбогатую цепь ДНК. Белки, связанные с теломерной ДНК . Теломеры на концах хромосом представляют собой особые структуры, позволяющие отличить концы хромосом от двухцепочечных разрывов. ДНК. В настоящее время нельзя с полной уверенностью сказать, что известны все белки, важные для поддержания структуры теломер. Однако некоторые белки изучены достаточно хорошо. Таблица 1. ТТЛОСЮ Все позвоночные iii iii i i Два вида класса Некоторые муравьи Ракообразное i . V . ТПАСЮв Большинство растений ii i, рожь, Кукуруза, ячмень, пшеница . ТТАвО Большинство насекомых некоторые ракообразные i . ТГАСОС Нематоды ii . ТТТААООО Томат . ТТССА i iv . Т.зТСм vii . Повтор 0 нуклеотидов i 1 iivi . Повтор 0 нуклеотидов i . Повторы ретро рансиозонов НеТЛ 6 кЬ и ТАКТ кЬ i i . ДНК взаимодейст вует белок 2 V , .