Специфичность метилирования ДНК растений при различных физиологических состояниях

• Автор: Дьяченко, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 116 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метилируемые последовательности эукариотических ДНК

1.2. Структура и функции цитозинС5ДНКметилтрансфераз

1.2.1. Первичная структура цитозинС5ДНКметилтрансфераз

1.2.2. Эукариотические ДНКметилазы

1.2.2.1. ДНКметилазы растений

1.2.3. Регуляция экспрессии ДНКметилазных генов

1.3. Функциональная роль метилирования ДНК растений

1.3.1. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина

1.3.2. Тотальное метилирование цитозина в ДНК растений и РНКинтерференция

1.3.3. Роль метилирования ДНК в развитии растений

1.3.4. Метилирование ДНК и геномный импринтинг
1.3.5. Влияние неблагоприятных условий окружающей среды на метилирование ДНК растений
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и оборудование
2.1.1. Оборудование
2.1.2. Реактивы, среды и ферменты
2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.4. Растительный материал
2.2. Методы
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние интеграции гена ДНКметилтрансферазы аИ1 на фенотип и картину метилирования СрЫрСпоследовательностей генома трансгенных клеток высших эукариот
3.1.1. Получение рекомбинантных плазмид с модифицирован геном ДНКметилтрансферазы 0.II для экспрессии
в клетках высших эукариот
3.1.2. Получение трансгенных растений Мсопапа гаЬасит, содержащих модифицированный ген МЬЗМГсоКН
3.1.3. Анализ метилирования ДНК трансформированных клеток человека НК3, экспрессирующих модифицированный ген НТ8МГсЫ1ИОРР
3.2. Исследование метилирования ДНК растений
МеестЬгуаппетит сгуМаНтпт в стрессовых условиях
IV. ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СОКРАЩЕНИЯ
I ГУК нафтилуксусная кислота
п.н. пара нуклеотидов
т.п.и. тысяча пар нуклеотидов
промотор РНК вируса мозаики цветной капусты
5 5азацитидин
6БАП 6бензиламинопурин азидодезокситимидин
i i метаболизм органических кислот по типу толстянковых
V вирус мозаики цветной капусты
v консервативные районы цитозинС5ДНКметилтрансфераз
СМТЗ растительная хромометилаза V цитомегаповирус
штамм .i, мутантный по цитозиновой ДНКметилтрансферазе
штамм .i, мутантный по цитозиновой ДНКметилтрансферазе
цитозинС5ДГЖметилтрансфераза мыши
1 цитозинС5ДНКметилтрансфераза человека
i растительная цитозинС5ДНК
метилтрансфераза
гистоновая ацетилтрансфераза гистоновая деацетилаза
i фракция мелких ЯраИфрагментов II бактериальная цитозинС5ДНКметилтрансфераза II 4,5 4,5диметил цитозин 4 4метилцитозин 5 5метилцитозин
МЕТ1 растительная цитозинС5ДНКметилтрансфераза
сигнал ядерной локализации
РЕРкарбоксилаза фосфоенолпируват карбоксилаза
процесс посттранскрипционного замолкания генов
рестриктаза
рестриктаза i
баденозилгомоцистеин
аденозилметионин
i короткие интерферирующие РНК
процесс транскрипционного замолкания генов
ii i вариабельный участок цитозннС5ДНКметилтрансфераз
убиквитинсвязывающие последовательности цитозинС5ДНКметилтрансфераз
ВВЕДЕНИЕ


Существенные успехи в исследовании функций метилирования ДНК получены после открытия белков, связывающихся с метилированными Срвпоследовательностями ДНК и мобилизующими в эти участки гистоновые деацетилазы, формирующие транскрипционно неактивную структуру хроматина. В этом смысле метилирование встречает ацетилирование ВеБЮг, , то есть метилирование ДНК и деацетилирование гистонов могут быть прочно сопряжены с процессом формирования нетранскрибируемой структуры хроматина. В структурнофункциональном исследовании энзиматического метилирования эукариотических ДНК существует значительный пробел, связанный с изучением только СрСтипа этой модификации. Только в настоящее время выясняется связь других сайтспецифических типов метилирования эукариотических ДНК с разными генетическими функциями. Растущее внимание к картине метилирования целого эукариотического генома, на фоне которого развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедеятельности клетки, ставит вопрос о понимании функционального значения этих типов метилирования ДНК и роли индивидуальных ДНКметилаз в специфических генетических процессах. Целью настоящей работы являлось изучение энзиматического метилирования ДНК растений при различных физиологических состояниях. Для экспрессии ДНКметилтрансферазы Мсо1Ш в клетках эукариот стояла задача получения модифицированных форм этого гена, кодирующих сигнал ядерной локализации. В число основных экспериментальных задач входили исследование эффекта переноса гена бактериальной ДНКметилтрансферазы со1П1 в геном растений Шсойапа 1аЬасит анализ уровня сайтспецифического метилирования ядерной ДНК и исследование картины метилирования некоторых генов растений МезетЬгуашИетит сгу5аШпит, растущих в экстремальных условиях засоления. До открытия эндонуклеаз рестрикции и разработки методов геномного секвснирования анализ метилированных последовательностей ДНК эукариот проводился с помощью различных энзиматических и химических методов специфической деградации ДНК. Эти методы позволяли специфически расщеплять ДНК до коротких олигонуклеотидов и анализировать главным образом ди и три нуклеотидные последовательности. Анализ ДНК различных растений и животных с помощью таких методов показал, что основное количество 5метилцитозина т5С сосредоточено в динуклеотиде 5 ii, ii, i, , i . Этот сайт чрезвычайно интересен тем, что у большинства исследованных эукариот частота его встречаемости значительно ниже ожидаемой. Так, в ДНК человека реальное содержание этого динуклеотида в раз меньше ожидаемого при случайном распределении. Причины такого дефицита могут определяться повышенной скоростью мутационного превращения ш5С в Т, что экспериментально показано, например, для горячей точки в ясопероне ДНК . Частота встречаемости динуклеотида и комплиментарного ему динуклеотада АрС эти последовательности возникают при дезаминировании т5С в Т раздел 1. ДНК тех видов, где было обнаружено повышенное содержание т5С и дефицит . Показано, что сама цитозиновая ДНКметилаза может с некоторой вероятностью дезаминировать образуемый т5С и превращать его в тимин i, . Позднее было показано, что для генома эукариот характерно наличие протяженных неметилированных последовательностей, обогащенных дину кпеотидам и островки. Исключение составляют островки в молчащих генах инактивированных Ххромосом i, i. При старении в нормальных тканях также наблюдается метилирование островков некоторых генов, в чем усматривается связь между старением и канцерогенезом I . I . В то же время обнаружено, что в культуре многих типов клеток мыши и человека около половины всех островков значительно метилированы. Это метилирование связано с тканеспецифическими генами но не с генами домашнего хозяйства и с потерей клетками своих специфических функциональных свойств в культуре . Таким образом, существует четкая корреляция между метилированием островков и подавлением транскрипции соответствующих генов. В то же время, метилирование островков приводит к образованию компактной и нечувствительной к нуклсазам структуры хроматина .