Структурный полиморфизм теломерных ДНК и их комплексообразование с белком PGEk - переносчиком нуклеиновых кислот

• Автор: Бессчётнова, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цели и задачи работы

1.3 Научная новизна и практическая значимость.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

2.1 Последовательности ДНК богатые гуанином.

2.2 Теломеры и теломераза

2.3 Способы подавления активности теломеразы.

2.4 Способы доставки нуклеиновых кислот в клетки и возможность использования белков переносчиков.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Образцы и их подготовка
3.2 Образование межмолекулярных и внутримолекулярных структур
3.3 Измерение спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма.
3.4. Анализ экспериментальных данных.
3.5. Молекулярное моделирование
3.6. Эксперименты на СФМ Сканирующем Силовом Микроскопе.
4. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ И СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ДВОЙНЫХ И ЧЕТВЕРНЫХ СПИРАЛЕЙ ТЕЛОМЕРНЫХ ДНК ИЗ ЭС,.2ТМ И 0ТТАССС4 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ. ВЛИЯНИЕ НА ВТОРИЧНУЮ СТРУКТУРУ ЛИГАНДОВ ИНТЕРКАЛЯТОРОВ
4.1. Использование флуоресцентных и кинетических
ПАРАМЕТРОВ ЕТВЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МОЛЕКУЛ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ ОБРАЗУЕМЫХ структур. .
4.2. Изучение адсорбции ЕтВя на теломерных ОЛИГОНУКЛЕОТИДАХ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ИХ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ.
4.3. Влияние ЕтВя на термическую денатурацию ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.
5. СВЯЗЫВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА РвЕК С ТЕЛОМЕРНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ РАЗЛИЧНОЙ КОНФОРМАЦИИ С ОБРАЗОВАНИЕМ АДРЕСОВАННЫХ ТРАНСПОРТНЫХ КОМПЛЕКСОВ
5.1. Изучение вторичной структуры олигонуклеотидов оТТАССО4, 8оТТАССО4, оТТАССО3, иЗТ и оАС.
5.2. Изучение связывания и динамики молекул РвЕк в КОМПЛЕКСЕ С ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ разной структуры
5.3. Изучение комплексов РОЕкДНК с помощью собственной УФФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БЕЛКА
6. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ РСЕКДНК
6.1. Влияние молекул РвЕк на вторичную структуру оТТАССС4 и ТТАССО4.
7. ИЗУЧЕНИЕ КОМПАКТИЗАЦИИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ПОД ВЛИЯНИЕМ СВЯЗЫВАНИЯ С РвЕК ПРИ ПОМОЩИ СКАНИРУЮЩЕГО СИЛОВОГО МИКРОСКОПА.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
БИБЛИОГРАФИЯ


Выявление структурной организации биологически активных белковонуклеиновых комплексов 4 и 4, подавляющих пролиферацию клеток аденокарциномы молочной железы человека линии 7. Исследование влияния молекул на структуру ДНК в этих комплексах. Научная новизна и практическая значимость. Проведено исследование необычных четырх и двухцепочечных структур, образованных из коротких . и последовательностей теломерных ДНК дрожжей vii и человека. В присутствии интеркалятора этидия бромида изучены энергетические параметры образования параллельного квадруплекса, состоящего из двух шпилек 3 553 ЬСН2СНз. Точечная замена концевого тимина на гуанин в 5 цепи приводит к образованию параллельной шпилечной структуры, 3 4 4 3 шпилька i . Экспериментально установлено уникальное свойство четверной спирали квадруплекса к двукратному растяжению, вызванному интеркаляцией . Показано, что взаимодействие с не влияет на термостабильность квадруплекса, квадруплекса и шпильки. В отличие от квадруплекса, квадруплекс из 4 повторов, характеризовался высокой стабильностью и жесткостью четверной спирали. Гибкая и лабильная структура квадруплекса может играть важную биологическую роль в инициации процессов связывания теломер с ферментами и регуляторными белками такими, например, как I белок известный стимулятор образования параллельных квадруплексов. Впервые изучена структурная организация комплексов, содержащих 3 последовательности, включающих квадруплексы, шпилечные структуры, а также 4, 2 и 2 последовательности в виде денатурированных нитей. . комплексов. Установлено высокое сродство молекул к ДНК разной вторичной структуры и нуклеотидного состава. Средняя константа диссоциации Кд 7 М. квадруплексу теломерной ДНК человека, образованному из 4 повторов, который является ингибитором теломеразы i vi 2 квадруплексная структура 4 сохраняется в составе комплексов 3 ДНКсвязывающий домен белка имеет высокую подвижность относительно адресующего домена белка . Определена структурная организация биологически активных комплексов 451 и 42, эффективно подавляющих пролиферацию раковых клеток линии 7 1С 0 нм. Установлено, что структура фосфодиэфирного квадруплекса 4 и денатурированной нити фосфоротиоатного 4 олигонуклеотида сохраняется в активных комплексах. Высокая подвижность в комплексах с ДИК важна для взаимодействия с рецепторами активно пролиферирующих эпителиальных клетокмишеней. Помимо фундаментальной направленности, работа имеет и практическую ценность. На основании полученных данных были оптимизированы условия доставки олигонуклеотидов в раковые клетки. Найденные закономерности образования комплексов могут служить основой для создания терапевтически значимых конструктов из олигонуклеотидов разной структуры с белковым вектором . Последовательности ДНК богатые гуанином. ДНК, богатая гуаниновыми повторами встречается в различных регуляторных областях генома . ДНК от простейших до млекопитающих ii А. Такие повторы не являются случайными. Это заставляет обратить внимание на их структурные свойства. богатые последовательности способны образовывать стабильные четырехцепочечные структуры, названные квадруплексами рис. I. Структура квадруплексов стабилизируется Хугстеновскими водородными связями в квартетах . i Т, . Рис. Схематично представлена организация вквартета и внутримолекулярного антипараллельного вквадруплекса из сТГЛСС4 повторов. Было показано, что теломерная последовательность с1С4ТпС4, где п 1 4 способна формировать как параллельный четырхцепочечный, гак и анти параллельный Сквадруплекс, в зависимости от количества тиминов в последовательности.