Участие адапторных белков RIL и TRIP6 в организации актинового цитоскелета и злокачественной трансформации

• Автор: Гурьянова, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

Список сокращений
I. Обзор литературы
1.1. Адапторные белки
1.1.1. Особенности ЫМ-доменов
1.1.2. Характеристика Р02-доменов
1.2. Ген ТШРб
1.3. Ген ШЬ
1.3.1. ШЬ - представитель семейства белков АЬРЛл^та
1.3.2. Происхождение и эволюционная консервативность семейства АЬР/Епідта
1.3.3. Геномная организация гена ШЬ человека
1.3.4. Альтернативные транскрипты гена ШЬ человека
1.3.5. Эволюционная консервативность ШЬ
1.3.6. Анализ экспрессии ШЬ и других членов семейства АЬР/Еі^та в различных тканях
1.3.7. Репертуар взаимодействий белка ШЬ
ШЬ взаимодействует с протеинтирозинфосфатазой РТР-ВЬ
Краткая функциональная характеристика РТР-Ван/РТР-ВЬ
ШЬ взаимодействует с ЫМ-доменным белком ТШР6
1.3.8. Роль ШЬ в поддержании структуры актиновых стресс-фибрилл
Краткая характеристика а-актининов
1.3.9. Транспортная функция ШЬ
1.3.10. Возможное участие ШЬ в злокачественной трансформации
1.3.11. Данные о дифференциальной экспрессии ШЬ, полученные с использованием микропанелей олигонуклеотидов

1.4. Лентивирусная система экспрессии
1.5. РНК-интерференция
II. Материалы и методы
II. I. Работа с культурами эукариотических клеток
И. 1.1. Клеточные линии, использованные в работе, и их культивирование
II. 1.2. Трансфекция
II.1.3. Упаковка лентивирусных частиц
II. 1.4. Очистка вирионов и трансдукция
II.1.5. Определение эффективного титра вирусных частиц и множественности
заражения клеток
II. 1.6. Оценка скорости клеточного деления
II. 1.7. Определение скорости миграции клеток
Метод «зарастания раны»
Оценка подвижности клеток с помощью трансмиграционных камер
И.1.8. Измерение клеточной адгезии
II. 1.9. Колониеобразование в полужидкой среде
II. 1.10. Проточно-цитометрический анализ
II.2. Работа с плазмидной ДНК и клонирование
И.2.1. Получение химически компетентных клеток E.coli
11.2.2. Трансформация химически компетентных клеток E.coli
11.2.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК
11.2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
11.2.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей
11.2.6. Лигирование ДНК
11.2.7. Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе

П.2.8. Получение конструкций, экспрессирующих немеченые белки и белки, слитые с эпитопами Flag, НА, GFP
11.2.9. Получение конструкций для экспрессии РНК-шпилек для РНК-интерференции
11.2.10. Получение репортерных конструкций
И.З. Выделение и анализ РНК
И.3.1. Выделение РНК, фракционирование и перенос на мембраны
11.3.2. Нозерн-блот анализ
11.3.3. ОТ-ПЦР
11.3.4. Выделение и анализ мРНК, связанной полисомами
II.4. Методы выделения и анализа белков
11.4.1. Получение тотальных клеточных лизатов
11.4.2. Получение Triton X-100-растворимой и нерастворимой фракций
11.4.3. Фракционирование белков, перенос на мембрану и иммунодетекция
11.4.4. Иммунопреципитация
11.4.5. Иммунофлюоресценция
11.4.6. Определение соотношения полимеризованного и неполимеризованного актина с помощью конфокальной микроскопии
11.4.6. Колориметрическое измерение активности Р-галактозидазы (ONPG-окрашивание)
11.4.7. Измерение активности люциферазы
11.4.8. Оценка времени полужизни белка
III. Результаты и обсуждение
III. 1. Оптимизация некоторых методов
III. 1.1. Оптимизация упаковки псевдовирусных частиц
III. 1.2. Оптимизация структуры РНК-шпильки для РНК-интерференции

тампоном, а клетки на нижней поверхности трансмиграционной вставки фиксировали метанолом и окрашивали метиленовым синим. Для количественной оценки миграции проводили обсчет клеток на нижней поверхности мембраны в пяти случайных полях зрения при световой микроскопии. Альтернативно, клетки, окрашенные метиленовым синим, лизировали в 0.1% БЭБ в фосфатно-солевом буфере и измеряли оптическую плотность полученного раствора при 600 нм (СЮйоо)-
Использовались трансмиграционные вставки с пористой мембраной (ВО Вюваепсеэ), размер поры - 8 мкм. Время миграции клеток определяли эмпирически для каждой клеточной линии.
11.1.8. Измерение клеточной адгезии
Перед началом эксперимента клетки инкубировали в бессывороточной среде в течение 4 ч., затем клетки трипсинизировали, дважды отмывали от трипсина в бессывороточной среде или фосфатно-солевом буфере, считали в камере Горяева, а затем при необходимости окрашивали витальным флюоресцентным красителем Сакет АМ (йтйч^еп) в соответствии с рекомендациями производителя. Равные количества клеток высевали в трех повторах в бессывороточной среде с добавлением 0.1% БСА в лунки планшетов, дно которых было заранее покрыто различными лигандами (фибронектином, фибриногеном). Клеткам давали прикрепиться в течение 30-120 мин., процесс адгезии клеток контролировали визуально под микроскопом. Неприкрепившиеся клетки дважды аккуратно отмывали теплым фосфатно-солевым буфером. Качественно адгезию оценивали визуально при световой микроскопии, а количественно - измеряя флюоресценцию кальцеина в зеленом спектре (использовали настройки для НТС). Оптимальное время прикрепления для каждой клеточной линии определяли эмпирически. На лунку 96-луночной плашки высевали по 5><104 клеток.