Роль факторов инициации в регуляции трансляции в клетках КРЕБС-2, зараженных вирусом энцефаломиокардита

• Автор: Дижур, Александр Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ИНИЩАЩИ ТРАНСЛЯЦИИ И ИХ УЧАСТИЕ В РЕГУЛЯЦИИ

СИНТЕЗА БЕЛКОВ

1.1. Общая характеристика факторов

инициации

1.2. Участие факторов инициации в сборке

инициаторного комплекса

1.3. Роль факторов инициации в регуляции

ранних этапов инициации трансляции .

1.4. Роль факторов инициации в регуляции связывания различных клеточных мРНК
с преинициаторным комплексом.
Глава 2. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЙКА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПНИ ПИКОРНАШРУСНОЙ ИНФЕКЦИЙ .
2.1. Подавление синтеза клеточных белков
при пикорнавирусной инфекции.
2.2. Кандидаты на роль вирусспецифического ингибитора трансляции
2.3. Нарушение активности кэпсвязывающих
белков в системах пикорнавирус
клетка с кинетикой угнетения синтеза
белка по типу I .
2.4. Конкуренция вирусных и клеточных мРНК в системах пикорнавирусклетка с кинетикой угнетения синтеза белка по
типу II .
2.5. Ионные условия в клетке и подавление
синтеза клеточных белков
2.6. Общее угнетение синтеза белка на
поздних стадиях инфекции
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Реактивы и биоматериалы.
3.2. Буферные растворы
3.3. Пассирование клеток Кребс2
3.4. Выращивание вируса ЭМК .
3.5. Выделение белков, меченных
радиоактивными аминокислотами
3.6. Определение радиоактивности в кислоторастворимой и кислотонерастворимой
фракциях из клеток Кребс2 .
3.7. Очистка вируса ЭМК и выделение
вирионной РНК
3.8. Выделение цитоплазматической полиАсодержащей РНК из клеток Кребс2 .
3.9. Выделение инициаторной тРНК из
клеток Кребс2 .
3 Аминоацилирование тРНКф 3Нметионином
3 Выделение суммарных факторов инициации из клеток Кребс2 и ретикулоцитов
кролика.
3 Бесклеточная белоксинтезирующая
система из клеток Кребс2
3 Анализ комплекса 3НметтРНКй Э субчастица рибосомы
3 Тестирование комплекса 3НметтРНКй
е1Б2ГТФ на нитроцеллюлозных
фильтрах .
3 Электрофорез белков в ПААГ с ДСН
и радиоавтография
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ РАННИХ ЭТАПОВ ИНИЦИАЦИИ
ТРАНСЛЯЦИИ В КЛЕТКАХ КРЕБС2, ЗАРАЖЕННЫХ ВИРУСОМ ЭНЦЕФАЛОШОКАРДИТА .
4.1. Изучение образования 5 преинициа
торного комплекса 1пшго
4.2. Изучение активности факторов инициации, участвующих в образовании Э преинициаторного комплекса ..
Глава 5. АКТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ ИНИЦИАЦИИ В ЗАРАЖЕННЫХ КЛЕТКАХ И ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ НА ОТНОСИТЕЛЬНУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ И ВИРУСНЫХ мРНК.
5.1. Влияние суммарных факторов инициации из зараженных клеток на трансляцию
меточных мРНК и РНК вируса ЭМК.
5.2. Влияние факторов инициации на трансляционную конкуренцию клеточных мРНК
и РНК вируса ЭМК.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .
вывода .
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Установлено, что факторы I2, 3 и 4В не снимают конкуренцию между РНК вируса ЭМК и клеточными мРНК в нефракционированной бесклеточной системе из клеток Кребс2, то есть эти факторы не лимитируют их совместную трансляцию. Полученные данные имеют значение для понимания механизмов регуляции трансляции у эукариот. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела взаимодействия вируса и клетки Межфакультетской проблемной НИЛ им. А.Н. Белозерского МГУ декабря г. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 7 страницах машинописного текста и состоит из разделов оглавление, введение, обзор литературы 2 главы, собственные исследования 3 главы, обсуждение, выводы, список цитированной литературы. Работа содержит рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 4 наименований. Все экспериментальные данные получены самостоятельно. Для эукариотической системы трансляции характерен сложный механизм инициации синтеза полипептидной цепи, в котором и субчастицы рибосомы объединяются с меттРНКф и мРНК в составе инициаторного комплекса с участием многочисленных белковых факторов и при обязательном гидролизе ГТФ и АТФ 3. I.I. К середине х годов нескольким группам исследователей удалось расфракционировать белковую фракцию, получаемую при промывании рибосом высокими концентрациями I, на несколько компонентов, абсолютно необходимых или существенно стимулирующих образование инициаторного комплекса в реконструированной системе, содержащей очищенные и субчастицы рибосомы, инициаторную меттРНК, мРНК и необходимые низкомолекулярные компоненты бесклеточной системы 4 ,6 ,3 . Номенклатура этих белковых факторов, использованная двумя группами, осуществившими наиболее полное фракционирование, а также единая номенклатура, принятая в г. В нижней части таблицы приведены факторы инициации, обнаруженные после года , 0 , 6. Не исключено, что этот список в будущем будет расширен. ПМ4 ВЕ4 еП РЕ6 еП Е4Е или КСБ 0 еГЕ4Е или КСБП 6 еБ Полипептидный состав факторов инициации приведен в таблице 2. Некоторые из них представлены одной полипептидной цепью, другие имеют сложную четвертичную структуру. Примечательно, что некоторые факторы могут быть выделены в виде множественных форм. Это относится прежде всего к факторам еП ГРЗ. Для еЕР2 показано, что гетерогенность полипептидного состава может отражать особенности функционирования фактора. ГР2 в форме оуз ив форме о у обладают одинаковой активностью , 5. Однако уЗ субъединица необходима для рециркуляции фактора при повторяющихся актах инициации 8. Известны множественные изоэлектрические формы еБ А, фосфорилированные формы еГРЗ, 4В и 5 7 , 7. Значение этих модификаций для регуляции активности факторов пока не изучено. Некоторые факторы представляют собой комбинацию других факторов с участием дополнительных полипептидов. Так в состав еГР4Б1 входят е Е4А и КСБ в комплексе с дополнительными полипептидами 6, в состав кофактора Е5Р, стимулирующего активность еБ2, входят два других кофактора 3 , 5. И4Т 4 инициаторного комплекса рис. Образование преинициаторного комплекса. Первым этапом инициации синтеза белка является присоединение меТтРНКф к субчастице, в котором можно выделить две стадии. Фактор еП На следующей стадии тройной комплекс присоединяется к субчастице , 5. Связывание меттРНКф еГГ2ГТФ с субчастицей может происходить без участия дополнительных факторов инициации, однако уровень образования и стабильность преинициаторного комплекса значительно повышаются в присутствии I4, IЗ и I1 6, 4. I2 и 3 единственные из факторов инициации, которые обнаруживаются в составе комплекса вплоть до этапа присоединения субчастицы 7. Факторы еИ4С и Iб стимулируют образование преинициаторного комплекса, поддерживая пул свободных субчастиц. Фактор Iб препятствует образованию неактивных рибосом, соединяясь с субчастицей 6, 6. Повидимому, примесью еГРб в препаратах фактора IЗ объясняется ранее наблюдавшаяся способность еП