Получение и исследование генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных форм

• Автор: Люкманова, Екатерина Назымовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТОКСИНОВ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ ИНГИБИТОРОВ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА

1.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор

1.2. Механизм активации канала.

1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора

1.4. Конотоксины

1.5. Нейротоксины из яда змей.

1.6. Взаимодействие нейротоксинов с никотиновым ацетилхолиновым рецептором

Глава 2. ПОЛУЧЕНИЕ аНЕЙРОТОКСИНОВ I VI.
2.1. Введение.
2.2. Экспрессия эукариотических полипептидов в . i
2.3. Прямая экспрессия генов нейротоксинов в .i.
2.4. Продукция нейротоксинов в виде гибридов с другими белками в .i.
2.5. Секреция нейротоксинов в .i
2.6. Твердофазный химический синтез.
ЧАСТЬ И. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1 Материалы.
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты
3.1.2. Штаммы.
3.1.3. Плазмидные вектора.
3.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур
3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды
3.2. Методы.
3.2.1. Трансформация клеток . i плазмидной ДНК
3.2.1.1. Приготовление компетентных клеток
3.2.1.2. Трансформация плазмидной ДНК.
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК.
3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК.
3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля.
3.2.6. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез
3.2.7. Полимеразная цепная реакция
3.2.8. Экспрессия гена нейротоксина II в виде слитной полипептидной цепи с геном тиоредоксина
3.2.9. Анализ локализации гибридного белка тиоредоксиннейротоксин II в клетках
3.2 Выделение и очистка гибридного белка
3.2 Выделение и очистка рекомбинантного нсйротоксина II.
3.2 Экспрессия гена нейротоксина И в секрстирующей конструкции
3.2 Анализ локализации секретируемых нейротоксинов в клетках . i
3.2 Выделение и очистка секретируемых нейротоксинов.
3.2 Аналитические методы
3 Электрофоретический анализ белков в ПААГ
3 Количественный анализ белковых препаратов.
3 Определение АМсонцевой последовательности полипептидов
3 Массспектромстрический анализ белковых препаратов
3.2 Методы структурных исследований.
3 Спектры НЯМР
3 Получение двумерных и трехмерных гетроядерных ЯМРспектров
3.2 Методы биологических исследований.
3 Анализ взаимодействия гибридного белка тиоредоксиннейротоксин II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором из ii.
3 Определение токсичности рекомбинантных токсинов.
3 Определение константы ингибирования нейрональных нАХР рекомбинантным нейротоксином II и мутантными нсйротоксинами.
3.2 Построение молекулярных моделей.
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
4.1. Конструирование гена нейротоксина II.
4.2. Конструирование гена тиоредоксина
4.3. Экспрессирующие вектора и биосинтез рекомбинантных токсинов в прокариотической системе . i
4.3.1.1. Сборка экспрессирующей конструкции для наработки слитного белка тиоредоксиннейротоксин II
4.3.1.2. Биосинтез нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином.
4.3.1.3. Выделение и очистка гибридного белка тиоредоксиннейротоксин II
4.3.1.4. ЯМРспектроскопия гибридного белка тиоредоксиннейротоксин II
4.3.1.5. Биологические свойства гибридного белка тиоредоксиннейротоксин И
4.3.1.6. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II
4.3.1.7. Анализ рекомбинантного нейротоксина II.
4.3.2.1. Экспрессирующая конструкция для секреции рекомбинантного нейротоксина II.
4.3.2.2. Секреция рекомбинантного нейротоксина II.
4.3.2.3. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II
4.3.2.4. Анализ рекомбинантного нейротоксина II.
4.3.2.5. ЯМРанализ рекомбинантного нейротоксина II.
4.3.2.6. Анализ токсичности рекомбинантного нейротоксина II.
4.3.3.1. Биосинтез изотопномеченых вариантов нейротоксина II.
4.3.3.2. Выделение и очистка изотопномеченых вариантов нейротоксина II.
4.3.3.3. ЯМРанализ чистоты и степени мечения препаратов изотопномеченых вариантов нейротоксина II.
4.3.3.4. Отнесение ЯМР спектров.
4.3.3.5. Исследование взаимодействия нейротоксина II с липидными бицеллами анизотропной средой, моделирующей биологическую мембрану
4.3.4.1. Конструирование мутантных вариантов нейротоксина II
4.3.4.2. Получение генов мутантных вариантов нейротоксина II и .
4.3.4.3. Биосинтез мутантных вариантов нейротоксина II и .
4.3.4.4. Выделение и очистка мутантных вариантов нейротоксина II и
4.3.4.5. Анализ рекомбинантных белков и
4.3.4.6. ЯМРанализ рекомбинантных белков и
4.3.4.7. Анализ биологической активности рекомбинантных белков и .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Получение и исследование различных мутантных вариантов нейротоксина II позволит не только понять принципиальные различия между короткими и длинными нейротоксинами, но и выявить механизмы, лежащие в основе взаимодействия молекул нейротоксинов с нАХР. АХР, таких как, аутизм 5, эпилепсия 6, депрессия, никотиновая 7 и алкогольная зависимости 8,9, болезнь Альцгеймера , паркинсонизм ,, мышечная дистрофия . Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось конструирование, получение и исследование физикохимических и биологических свойств генноинженерного нейротоксина П и его мутантных вариантов. Основные задачи исследования. Получить ген нейротоксина II, а также вектора для экспрессии в прокариотической системе ii i, и разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного нейротоксина. Наработать генноинженерный нейротоксин II в необходимых для исследований количествах. Изучить физикохимические и биологические свойства нейротоксина И. Осуществить теоретический дизайн мутантных вариантов нейротоксина II из яда кобры xi. Получить гены мутантных вариантов нейротоксина II. Наработать мутантные варианты нейротоксина II в необходимых для исследований количествах. Исследовать физикохимические и биологические свойства полученных рекомбинантных нейротоксинов и выявить роли конкретных аминокислотных остатков в распознавании мускульного и нейрональных нАХР различных подтипов а7, а3. Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. I.
1. Разработаны высокопродуктивные экспрессионные системы, позволяющие получать нейротоксины, белки со значительным содержанием дисульфидных связей, в препаративных количествах. Впервые проведено генноинженерное конструирование химерного нейротоксина с заданной специфичностью. Впервые получен пС,5Ымеченый нейротоксин, и проведено полное отнесение его ЯМР сигналов. Впервые изучено взаимодействие коротких анейротоксинов с окружением, моделирующим липидный бислой. Исследованы биологические свойства рекомбинантных белков. Показано, что гибридный белок тиоредоксиннейротоксин II обладает активностью по отношению к нАХР мускульного типа, сопоставимой с активностью природного нейротоксина И. Рекомбинантный нейротоксин II практически полностью воспроизводит активность природного токсина. Полученные генноинженерным путем мутантные варианты нейротоксина II с модифицированной центральной петлей, соответствующей петле нейротоксина I с некоторыми заменами, обладают способностью взаимодействовать с нейрональными нАХР. Причем, активность одного из мутантных вариантов по отношению к нейрональному нАХР а7 типа близка к активности нейротоксина I. АХР со своими лигандами, что, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения создания эффективных терапевтических средств для лечения заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией нАХР. ЧАСТЬ I. Глава 1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор относится к классу лигандзависимых ионных каналов, встроенных в постсинаптическую мембрану нейронов, основной функцией которых является быстрая нейропередача 2,. Благодаря своей способности преобразовывать межклеточные сигналы, нАХР играет ключевую роль в развитии и возникновении ряда заболеваний центральной нервной ситемы, таких как шизофрения , эпилепсия 6,, депрессия, никотиновая 7 и алкогольная зависимости 8,9, болезнь Альцгеймера , паркинсонизм ,, мышечной дистрофии ,, аутизма 5,,. Например, мутации в нАХР аксона, препятствующие нормальной передаче импульса, лежат в основе миастении, а отсутствие а4 субъединицы у нАХР в коре мозга сопряжено с болезнью Альцгеймера. Кроме того, в последнее время появились данные, указывающие на то, что для ингибирования высвобождения макрофагами ТОБ фактора, приводящего к таким заболеваниям как эндотоксемия, сепсис, ревматоидный артрит и воспаление прямой кишки необходимо наличие нАХР а7 нейронального типа . Таким образом, изучение механизмов взаимодействия лигандзависимых ионных каналов со своими лигандами интересно не только как фундаментальная задача биологии, но и с точки зрения разработки новых медицинских препаратов и тестсистем.