ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов

• Автор: Козлов, Алексей Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Генетическая иммунизация

Глава 2. ДНКиммунизацня при герпетических инфекциях.

2.1 Классификация герпесвирусов.

2.2 Пути передачи ВПГ.

2.3 Строение ВПГ

2.4 Взаимодействие вируса с клеткой.

2.5 Иммунный ответ при герпетической инфекции.

2.6 Современные вакцины против ВПГ
2.6.1 Инактивированные вакцины.
2.6.2 Субъединичные вакцины
2.6.3 Живые аттенуированные, генноинженерные вакцины.
2.7 ДНКвакцины против ВПГинфекции.
2.8 Адъюванты для ДНКвакцин
Глава 3. ГМКСФ и ФНО как потенциальные адъюванты для ДНКвакцин.
3.1 ГМКСФ гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор
3.2 Фактор некроза опухоли ФНО
Глава 4. Отечественные иммуномодуляторы нового поколения.
4.1 Глюкозаминилмурамилдипептид ГМДП.
4.2 Гепон.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
5.1 Получение гибридом, продуцирующих МКА к белкам ВПП.
5.1.1 Иммунизация
5.1.2 Миеломная клеточная линия
5.1.3 Культивирование клеток.
5.1.4 Слияние клеток и выращивание гибридом.
5.1.5 Криоконсервирование гибридом.
5.1.6 Получение асцитных жидкостей, содержащих МК
5.1.7 Получение МКА из асцитных жидкостей
5.1.8 Определение концентрации белка.
5.1.9 Субтипирование МКА.
5.1. Твердофазный иммуноферментный анализ ИФА
5.1. Непрямой иммунофлюоресцентный анализ нИФ
5.2. Животные
5.3. Вирус и клетки
5.4. Определение летальной дозы ВПГ1.
5.5. Иммуноген плазмида .
5.6. Выделение рекомбинантного фактора некроза опухоли мышей мФНОа
5.7. Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного
5.8. Конструирование плазмиды для эукариротической экспрессии гена мышиного гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора .
5.9. Трансфекция i vi
5 ДНКиммунизация
5 Изучение активности антител к ВПГ1.
5 Реакция нейтрализации
5 Определение ВПГспецифических иммуноглобулинов класса I и I2
5 Определение количества 4 и 8 Тлимфоцитов.
5 Определение пролиферативного ответа Тлимфоцитов.
5 Активность интерферона ИФа.
5 Протективный ответ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Глава 6. Получение и характеристика МКА к ВПГ.
6.1 Слияние и скрининг гибридом.
6.2 Характеристика МКА
6.2.1. Активность МКА в реакции нИФ.
6.2.2. Активность МКА в реакции ИФА.
6.2.3. Субтипирование I, представляющих МКА
6.2.4. Способность МКА подавлять инфекционную активность ВПГ в реакции нейтрализации.
Глава 7. Определение летальной дозы ВПГ.
Глава 8. Трансфекция i vi.
Глава 9. Генетическая иммунизация i viv.
9.1. Изучение динамики клеточного и гуморального иммунного ответов на
введение плазмиды , содержащей ген ВПГ1.
9.2. Исследование действия ФИО на иммунный ответ при иммунизации
животных
9.3. Исследование адъювантного действия ГМКСФ на ДНКиммунизацию
мышей против герпетической инфекции
9.4. Влияние ГМДП на иммунный ответ при ДНКиммунизации против
вируса простого герпеса
9.5. Исследование адъювантного действия препарата Гепон на ДНК
иммунизацию животных против ВПГинфекции.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Показана способность полученных МКА выявлять белок i i в эукариотических клетках, трансфицированных ДНКконструкцией i vi, а также в клетках, инфицированных ВПГ12. Установлена оптимальная схема введения i viv. Определены сроки формирования максимальных уровней Т и Вклеточных иммунных ответов и длительность циркуляции антиВПГ1 антител. Проведен сравнительный анализ адъювантных свойств белка мФНО, , , ГМДП и Гепона и установлено, что и ГМДП существенно повышают эффективность защиты животных от заражения летальными дозами ВПГ1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Генетическая иммунизация. Вакцины одно из самых значительных достижений медицины. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные препараты для предупреждения многих распространенных инфекционных заболеваний. Кроме того, увеличились заболевания, обусловленные теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. В связи с этим актуальным является поиск новых вакцинных препаратов, обладающих высокой иммуногенностью и способных активировать оба типа иммунного ответа клеточный и гуморальный. В настоящее время используется 4 основных вида противовирусных вакцин, которые разделяют в зависимости от методов их получения. Одним из них являются вакцины на основе живых аттенуированных вирусов. Опасность применения этих препаратов связана с возможностью появления спонтанных мутаций, приводящих к восстановлению вирулентности. Второй тип инактивированные вакцины. К недостаткам вакцин на основе инактивированного вируса относится опасность заражения в случае его неполной инактивации. В последнее время получили распространение вакцины третьего типа субъединичные вакцины. Однако, наработка вирусного антигена в промышленном масштабе, очистка и выделение вирусных белков предполагает большие материальные затраты и необходимость работы с инфицированным материалом. Вакцины этого типа в большинстве случаев характеризует меньшая иммуногенность по сравнению с вакцинами на основе природных антигенов. Кроме того, белки, полученные методами генной инженерии, бывает трудно выделить и очистить, что сильно удорожает их использование на практике. В последние годы все большее внимание исследователей привлекает новое направление в разработке вакцин, связанное с генетической иммунизацией ДНКиммунизацисй. Идеи о возможности введения в организм генов с лечебной целью бьши высказаны еще в начале х годов прошлого века, однако реальные попытки такого рода относятся к концу х годов . В году была осуществлена попытка лечения тяжелого, обычно несовместимого с жизнью наследственного иммунологического заболевания иммунодефицита, вызванного дефектом в гене, который кодирует синтез фермента аденозиндезаминазы . У двух девочек в возрасте до четырех лет, страдавших врожденным дефектом в гене , были взяты клетки костного мозга и перенесены в питательную среду для роста вне организма. В эти клетки был введен ген . Затем трансфицированные клетки были размножены в культуре, после чего введены больным, от которых они были получены. Авторы сообщили о четко выраженном лечебном эффекте . Хотя впоследствии возник ряд сомнений в устойчивости полученного эффекта и его конкретных механизмах, именно эта работа послужила мощнейшим толчком для развития генной терапии. Уже в годах несколько независимых групп исследователей экспериментально доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного способствует формированию иммунитета 0. Принцип применения ДНКвакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки вирусов или патогенных микроорганизмов. В организме хозяина выбранный ген экспрессируется и индуцирует клеточный и гуморальный иммунный ответ. Для получения ДНКвакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного белка вируса, встраивают в бактериальную плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой ДНК, которая способна к репликации в бактериальной клетке.