Влияние интеграций LTR эндогенных ретровирусов на экспрессию соседних генов

• Автор: Илларионова, Анна Эдуардовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

1.1. Перемещающиеся элементы генома

1.1.2. Ретроэлементы

1.1.1.1. Ретротранспозоны

1.1.2. Ретровирусы.

1.1.3. Эндогенные ретровирусы

1.1.3.1. Строение эндогенных ретровирусов человека.

1.1.3.2. Происхождение эндогенных ретровирусов.

1.1.3.3. Классификация эндогенных ретровирусов.

1.1.3.4. Представленность и распределение V в геноме человека

1.1.3.5. Участие V в нормальных и патофизиологических процессах, протекающих в клетке

1.3.1.6. Участие V в эмбриогенезе и развитии плаценты

1.1.3.7. Различия в структуре , влияющие на их транскрипционную активность.
1.1.3.8. Эндогенные и экзогенные факторы, влияющие на экспрессию V
1.1.3.9. Влияние эндогенных ретровирусов и одиночных на функционирование генома человека.
. 1.4. Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека, как возможные
факторы его эволюции.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование
2.1.2. Расходные материалы.
2.1.3. Реактивы и ферменты.
2.1.4. Буферные и концентрированные растворы.
2.1.5. Препараты геномной ДНК
2.1.6. Ткани.
2.1.6. Штаммы, культуры, плазмиды
2.1.7. Праймеры, последовательность нуклеотидов
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение РНК.
2.2.1.1. Подготовка тканей.
2.2.1.2. Подготовка клеток.
2.2.1.3. Выделение РНК.
2.2.1.4. Определение концентрации РНК
2.2.1.5.Анализ выделенной РНК методом гельэлектрофореза.
2.2.1.6. Обработка препарата РНК ДНКазой.
2.2.2. Синтез первых цепей кДНК на матрице суммарной РНК.
2.2.3. Выделение ДНК.
2.2.3.1. Выделение плазмидной ДНК
2.2.3.2. Выделение высокомолекулярной ДНК
2.2.4. Очистка олигонуклеотидных праймеров.
2.2.5. Полимеразная цепная реакция .
2.2.5.1. Стандартная пропись амплификации
2.2.5.2. амплификация.
2.2.5.3. Приготовление матрицы для из суспензии клеток.
2.2.6. Электрофорез в агарозном геле.
2.2.7. Определение концентрации фрагментов ДНК.
2.2.8. Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и фрагментов на автоматическом секвенаторе.
2.2.9. Трансформацш1 . i
2.2 Рестрикция и лигирование
2 Аналитическая рестрикция выделенных плазмид
2 Препаративная рестрикция, выделение и очистка плазмид и фрагментов ДНК.
2 Лигирование
2.2 Культивирование клеток
2.2 Трансфекцш1 клеток
2.2 Позитивнонегативная селекция.
2.2 Получение клеточного лизата.
2.2 Определение количества белка
2.2 Определение флуоресценции в кпеточных лизатах
2.2 Определение активности люциферазы.
2.2 5 i iii 5
2.2 Программное обеспечение.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Теоретическое обоснование работы и экспериментальные задачи
3.2. Анализ траискрипта, содержащего в своем составе V.
3.3. анализ локусов, различающихся по присутствию V
3.4. Филогенетический анализ представителей подсемейства I генома человека.
3.5. Определение возраста интеграции в предковую последовательность содержащих генов.
3.6. Сравнение последовательностей представителей подсемейства различных приматов.
3.7. Анализ транскрипции генов подсемейства I.
3.7.1. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА в нормальных тканях человека.
3.7.2. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АП5 в опухолевых тканях человека и трансформированных клеточных линиях
3.7.3. Анализ транскрипции генов подсемейства К1АА в эмбриональных тканях человека.
3.7.4. Анализ транскрипции содержащих генов подсемейства I.
3.7.5. Вклад каэсдого из содержащих генов в общую транскрипцию.
3.8. Экспериментальное подтверждение энхансерной активности исследуемого . .
3.9. Роль в транскрипции генов подсемейства I
3.9.1. Расположение генов па хромосомах.
3.9.2. Анализ регуляторных последовательностей в промоторных областях генов
3.9.3. Метилирование промоторных областей генов.
ЗЛО. Анализ иромо горной активности исследуемого IIV
3 Определение промоторной активности исследуемого i vi.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ВВЕДЕНИЕ


НЕЯУК на регуляцию экспрессии генов человека и является частью комплексных исследований, проводимых Лабораторией Структуры и Функций Генов Человека, посвященных влиянию повторяющихся элементов на функционирование геномов человека и других видов приматов. В процессе проведения данной работы впервые было найдено и описано семейство генов, некоторые члены которого различаются между собой интеграцией ЬТИ НЕКУК в один из интронов. Среди данного семейства выделяется подсемейство, представляющее собой уникальную природную модель, поскольку в пего входят гены, практически идентичные по структуре, но различные по присутствию ЬТК НЕКУК. В экспериментах i vi была показана тканеспецифичная энхансерная активность , входящего в состав подсемейства, а также его нромоторный потенциал. Достоверность полученных результатов была подтверждена всеми необходимыми контролями. Таким образом, мы показали, что присутствие играет важную роль в регуляции транскрипционной активности подсемейства генов . I, причем такое воздействие на транскрипцию генов происходит в одинаковых внутриклеточных условиях. ГЛАВА 1. Перемещающиеся элементы , ТЕ генома это специализированные фрагменты ДНК, с характерной структурной организацией, обладающие способностью перемещаться по геному клеткихозяина. Размер перемещающихся элементов составляет от нескольких сотен до десятков тысяч нуклеотидных пар ДНК. Способность к перемещениям определяется особенностями их структуры и наличием ферментов, обеспечивающих перемещения транспозиции. Перемещения осуществляются либо путем вырезания элемента из одного локуса генома и интеграции его в другой, либо путем образования копии перемещающегося элемента, внедряющейся в новый локус, тогда как исходный элемент остается в прежнем локусе. В последнем случае будет происходить размножение ТЕ, увеличение их числа в геноме. В некоторых случаях перемещающийся элемент, покидая хромосому, оставляет след своего присутствия, локально изменяя нуклеотидную последовательность ДНК. Перемещающиеся элемен ты, встраиваясь в гены или окрестности генов, вызывают мутации. Они обладают способностью изменять уровень активности близлежащих генов и играют важную функциональную роль в поддержании целостности генома . Перемещающиеся элементы могут составлять до всей последовательности генома клетки хозяина 1,, . Обычно они рассеяны по геному, но в отдельных участках хромосом может происходит их локальная концентрация, обусловленная увеличенной частотой интеграции перемещающихся элементов в данный локус . В настоящее время существует несколько способов классификации перемещающихся элементов. В данном обзоре будет рассмотрена одна, наиболее распространенная. Согласно ей, ТЕ делятся на I и II класс 1,. Класс I включает в себя перемещающиеся элементы, распространяющиеся по геному через РНК в качестве промежуточного продукта. К этому классу мобильных элементов относятся ретропозоны I I , ретротранспозоны, среди которых различают содержащие и не содержащие длинные концевые повторы i , эндогенные ретровирусы vi V, а также процессироваыные псевдогены 1,. Элементы, перемещающиеся по геному без образования промежуточного РНКиродукта, относят к классу II. Процесс их транспозиции проходит путем вырезания мобильного элемента ферментом транспозазой и его реинтеграции в новый участок генома. К этому классу относятся инсерционные последовательности прокариот и ДНК транспозоны , , ,,,. РНК к ДНК. ДНКкопии в геном клетки. I и процессированные псевдогены , . Рис. Процесс ретротранспозиции, на примере эндогенных ретровирусов V. V i , прямые повторы стрелкой на первом рисунке обозначен промотор. Второй класс ретроэлементов представляет собой ретротранспозоны, содержащие и не содержащие , а также эндогенные ретровирусы vi V. Ретротранспозоны кодируют и другие белки необходимые для их интеграции в геном. Зконцах имеют повторы 0 п. Ретротранспозоны, содержащие , обнаружены во всех хорошо изученных эукариотических геномах , . Полноразмерные ретроэлементы данного класса имеют либо единственную , включающую в себя гены, либо 2 отдельных генов и см.