Секвенирование и анализ организации генома вируса оспы коров штамм GRI-90

• Автор: Сафронов, Павел Федорович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 179 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОРТОПОКСВИРУСЫ МЕЖВИДОВЫЕ И ВНУТРИВИДОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ.

1. Основы видовой дифференцировки ортопоксвирусов

2. Белооспинные мутанты ортопоксвирусов

3. Функциональная роль генов, расположенных в теломерных областях

3. 1 Молекулярные факторы вирулентности.

3.1.1 Ингибиторы апоптоза инфицированных клеток.

3.1.2 Ингибиторы воспалительных реакций.

3.1.3 Ингибиторы действия интерферона.

3.1.4 Модуляторы иммунного ответа.
3.2 Гены круга хозяев.
3.3 Семейство Ке1сбелков
4. Тельца включения типа А ортопоксвирусов.
5. Внутривидовая вариабельность вируса оспы коров
6. Заключение по обзору литературы.
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы.
2. Методы
2.1. Очистка вируса и выделение вирусной ДНК
2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.3. Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля на ионообменную бумагу диэтиламиноэтилцеллюлоза.
2.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля при помощи набора СЛАяшск фирмы САСЕИ, Германия
2.5. Получение компетентных клеток. Трансформация Е.соН.
2.5.1. Приготовление компетентных клеток
2.5.2. Трансформация.
2.6. Клонирование концевых фрагментов ВОК штамма I.
4 2.7Отбор клонов по гибридизации i i.
2.8. Выделение плазмидной ДНК.
2.9.Секвенирование по методу Максама и Гилберта.
2.9.1 Введение радиоактивного по ЗОН концам фрагментов
ДНК при помощи фрагмента Кленова ДНК полимеразы I .i.
2.9.2. Модификация азотистых оснований
2.9.3. Расщепление ДНК с помощью пиперидина.
2.9.4. Электрофорез в денатурирующем ПААГ.
2 Секвенирование на автоматическом секвснаторе
2 Компьютерная обработка расшифрованной последовательности геномной ДНК.
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Создание и характеризация клонотеки фрагментов генома I.
2. Секвенирование генома I
2.1. Секвенирование ДНК ВОК по методу МаксамаГилберта
2.2 Секвенирование ДНК ВОК на автоматическом анализаторе
I I
3. Построение трансляционной карты генома.
4. Сравнение геномов
4.1 Центральная область генома.
4.2 Концевой инвертированный повтор I
4.3 Уникальная последовательность концевых видоспецифичных районов
4.3.1. Потенциальные гены круга хозяев.
4.3.2. Семейство бслков
4.3.3. Молекулярные факторы вирулентности
4.3.4. Тела включения типа А.
Глава IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
I СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГантиген
ак аминокислота
ВНО вирус натуральной оспы
I, штамм Ii
ВНО, штамм
ВОВ вирус осповакцины
ВОВСОРВОВ, штамм
ВОВ, штамм
ВОК вирус оспы коров
I ВОК, штамм I
I ВОК штамм i
вирус оспы обезьян
I вирус оспы обезьян, штамм iI
ВОВБ вирус оспы верблюдов
ВЭ вирус эктромелии
ВЭ ВЭ, штамм
дцРНК двухцепочечная РНК
е.а. единицы активности
кДа килодальтон
оптические единицы
ООЕ оспинаобразующая единица
ОРТ открытая рамка трансляции
ПААГ полиакриламидный гель
ПСА персульфат аммония
РКЭ развивающийся куриный эмбрион
,, тетраметилэтилендиамид
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов п.н. пар нуклеотидов
Трис трисгидроксиметиламинометан
ХАО хорионаллантоисная оболочка
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
I эозинофильные включения типа ii
I V вирионы интегрированы в I
I V I гомогенные без вирионов
I V1 вирионы располагаются по периферии I
V ассоциированный с клеткой вирион i v vi
СНО линия клеток китайского хомячка i v
модулятор действия цитокинов i i
Vвнеклеточный оболочечный вирион x v vi круг хозяев
IV внутриклеточный оболочечный вирион i v vi I интерферон I
I интерлейкин Ii
IV внутриклеточный зрелый вирион i vi
I изопропилбетаБтиогалактопиранозид Iii
IVнезрелый вирион i vi
лизофосфолипаза i
неповторяющиеся последовательности i
фосфолипаза i
додецилсульфат натрия i
I ингибиторы сериновых протсаз i Iii
Iконцевые инвертированные повторы i Iv
фактор некроза опухолей i
V комплемент связывающий белок Vi ii i V вирусный фактор ранней транскрипции Vi ii
V вирусный фактор роста Vi
VI вирусный фактор промежуточной транскрипции Vi Ii ii
V вирусный фактор поздней транскрипции Vi ii
ВВЕДЕНИЕ


Целью настоящей работы было определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса оспы коров штамм , анализ организации его генома и сравнение с геномами других ортопоксвирусов. ВОК генов и поиск по банку данных их функциональных аналогов. Получена библиотека гибридных плазмид, несущих фрагменты генома ВОК штамм ВОКОЯ1. Геном ВОКОШ представлен в коллекции на . Определена полная нуклеотидная последовательность генома ВОКОШ. Международный банк данных i под регистрационным номером Х5. Обнаружено, что штаммы вируса оспы коров I и I обладают самым протяженным геномом и наиболее полным набором вирусных генов среди изученных ортопоксвирусов. На основании этих данных сделано предположение, что ВОК наиболее древний среди рассматриваемых ортопоксвирусов, а такие виды как ВНО, ВЭ и ВОВ образовались в результате их независимой эволюции от общего ВОКподобного вирусалрародителя. Выявлена общая закономерность для всех видов ортопоксвирусов в отношении типа генов, разрушенных в процессе эволюции. Большинство делегированных или разрушенных генов ВНОI, ВОВСОР и ВЭ принадлежат либо к генам анкиринподобных белков, либо к генам, либо к генам, кодирующим молекулярные факторы вирулентности. Обнаружено, что на фоне высокой внутривидовой гомологии штаммов ВОВ, ВНО и ВЭ внутривидовая гомология генов ВОК в концевых вариабельных областях генома невысока, что может указывать на большее внутривидовое разнообразие ВОК по сравнению с другими видами ортопоксвирусов. Нуклеотидная последовательность генома I может быть использована для поиска специфичных для вируса оспы коров районов с целью разработки аналитичеких систем для диагностики ортопоксвирусов. Коллекция плазмид со встроенными фрагментами генома I может быть использована для изучения биологических функций индивидуальных вирусных генов. Сафронов П. Ф., Петров Н. А., Рязанкина О. И., Тотменин А. В., Щелкунов С. Н., Сандахчиев I Гены круга хозяев вируса оспы коров. Докл. РАН. Т. 9. С. . Щелкунов С. Н., Сафронов П. Ф., Тотменин А. В., Рязанкина О. И., Петров Н. А., Гуторов В. В., Сандахчиев I Множественные гены белков семейства рецептора фактора некроза опухолей у вируса оспы коров. Докл. РАН. Т. 0. С. . V., v . О. I. V. V. Vi. V. 3. Рязанкина О. И., Туманова О. Ю., Колосова И. В., Сафронов П. Ф., Каблова Г. В., Щелкунов С. Н. Структурнофункциональная организация генома вируса оспы коров, штамм I. ДНК полного генома ВОК. Сафронов П. Ф., Рязанкина О. И., Петров Н. А., Тотменин А. В., Колосова И. В., Щелкунов С. Н. Структурнофункциональная организация генома вируса оспы коров, штамм I. II. Сравнительный анализ структуры левого видоспецифичного района генома ортопоксвирусов. Молекулярная биология, Т. С. . Сафронов П. Ф., Тотменин , Рязанкина О. И., Щелкунов С. Н. Структурно функциональная организация генома вируса оспы коров, штамм I. III. Функциональная характеристика левого видоспецифичного района генома. Молекулярная биология, т. Секвенирование ДНК вируса оспы коров выполнено автором совместно с Петровым, В. В. Гуторовым и М. В. Михеевым. Компьютерный анализ организации генома I ВОК, анализ различий в нуклеотидных последовательностях ДНК вирусов оспы коров, эктромелии, натуральной оспы и осповакцины выполнены лично автором. Создание и характеризация клонотеки фрагментов геномной ДНК штамма I ВОК выполнено О. И. Рязанкиной при участии автора. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Отнесение вируса к тому или иному виду ортопоксвирусов, традиционно, основывалось на целом ряде биологических характеристик см. ХАО РКЭ . Как видно из таблицы 1, эти и другие признаки могут варьировать в пределах одного вида. Так, следует отметить, что у некоторых изолятов ВОК от животных при их первичном выделении на куриных эмбрионах геморрагии мало выражены. С дальнейшими пассажами оспины приобретают характерный для вируса оспы коров вид. Указанные различия следует отнести за счет адаптации штаммов к ХАО при их пассировании на эмбрионах. По этой же причине, возможно, штаммы первой группы репродуцировались на ХАО при С, тогда как остальные уже при . С не образовывали оспин. Маренникова и Щелкунов, . Как известно, ортопоксвирусы характеризуются высокой частотой образования делеционных мутантов.