Взаимодействие компонентов системы инициации трансляции с цитоскелетом

• Автор: Иванов, Павел Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил

1. Иммобилизация и транспорт компонентов

аппарата трансляции в цитоплазме.

Иммобилизация компонентов аппарата трансляции в цитоплазме

Специфическая локализация мРНК в специализированных клетках

Специфическая локализация мРНК в неспециализированных

клетках.

Активный транспорт белковых компонентов аппарата трансляции

2. Стрессовые гранулы

3. Инициация трансляции

Кэпнезависимая инициация трансляции.

Регуляция инициации трансляции.

4. Фактор инициации трансляции 3 I
Мотивы, содержащиеся в субъединицах I3.
Фактор инициации I3 почкующихся дрожжей . vii.
Фактор инициации I3 делящихся дрожжей . .
Фактор инициации I3 человека.
5. Большая субъединица фактора инициации 3 I3.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Работа с ДНК
Бактериальные штаммы и среды.
Полимеразная цепная реакция
Рестрикция и лигирование.
Приготовление компетентных клеток и трансформация клеток
. i плазмидной ДНК.
Выделение плазмидной ДНК.
Электрофорез ДНК и элюция из геля
2. Работа с белками
Синтез белков в . i
Очистка рекомбинантных белков, трансляционно слитых с
глютатионтрансферазой
Очистка рекомбинантных белков, трансляционно слитых с 6 i
Получение поликлональных антител.
Очистка поликлональных антител.
Другие использованные в работе антитела
Электрофорез белков и иммуноблотинг
Выделение тубулина из мозга крупного рогатого скота
Получение МТ из раствора тубулина
3. Работа с культивируемыми клетками млекопитающих.
Клеточные культуры.
Трансфекция культивируемых клеток
Фиксация культивируемых клеток.
Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток.
Прямое флуоресцентное окрашивание культивируемых клеток
Количественные наблюдения клеток с стрессовыми гранулами и статистическая обработка результатов.
Преципитация белков из лизат клеток рекомбинантными
фрагментами р0, иммобилизованными на агарозе.
4. Буферные растворы
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Изучение формирования стрессовых гранул.
Качественные исследования стрессовых гранул
Выявлении стрессовых гранул с использованием антител к и
Выявление РНКсвязываюшего белка р в составе стрессгранул
Изучение солокализации стрессовых гранул с актиновыми
филаментами и микротрубочками
Подавление образования стрессовых гранул в клетках
с разрушенными микротрубочками.
Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток с подавленным
образованием стрессовых гранул на РАВР.
Разрушение микротрубочек не влияет на фосфорилирование
I2 при последующей индукции стрессовых гранул.
Образование стрессовых гранул при восстановлении
Микротрубочек в присутствии арсената натрия
Предобработка клеток винбластином
Предобработка клеток таксолом
Предобработка клеток латранкулином В.
Количественные исследования стрессовых гранул
минут инкубации с арсснатом.
Сравнение доли клеток со стрессовыми гранулами при различных условиях предобработки клеток
мин. инкубации с арсснатом
Сравнение количества стрессгранул в клетках при различных условиях предобработки клеток
мин. инкубации с арсснатом
Сравнение относительного количества мелких стрессгранул при различных условиях предобработки клеток мин. инкубации
с арсенатом.
Сравнение количества крупных стрессгранул при различных
условиях предобработки клеток мин. инкубации с арсенатом
0минутная инкубация с арсенатом.
Сравнение доли клеток с стрессгранулами при различных
условиях предобработки 0 мин. инкубации с арсенатом
Сравнение относительного количества стрессгранул в клетках при различных условиях предобработки 0 минут инкубации
с арсенатом.
Сравнение относительного количества мелких стрессгранул при различных условиях предобработки клеток 0 мин. инкубации
с арсенатом.
Сравнение количества крупных стрессгранул при различных
условиях предобработки клеток 0 мин. инкубации с арсенатом
2. Изучение взаимодействия большой субъединицы I3
с микротрубочками
Анализ первичной и предсказанной вторичной структуры белка р0 Клонирование полноразмерного р7 и его отдельных фрагментов
концевоо, центрального, Сконцевого и короткого Сконцево о
без аминокислотных повторов
Характеристика антител к фрагмент р0Сс
Установление идентичности белка, выявляемого антителами АПОСс,
и большой субъединицы фактора I3 р
Выявление р0 в препарате микротрубочек на различных
стадиях очистки микротрубочек.
Иммунофлуоресцснтное выявлние локализации белка р
в клетках V
Экспрессия в клетках полноразмерного р 0 и его фрагментов.
трансляционно слитых с
Экспрессия полноразмерного i.
Экспрессия концевого фрагмента
Экспрессия центрального фрагмента р0М.
Экспрессия Сконцсвого с повторами фрагмента р0С.
Экспрессия Сконцевого без повторов фрагмента р0Сс.
Соосаждение тубулина с концевой областью i .
экспрессированной в .i, из лизата клеток
Соосаждение тубулина с концевой областью р0,
экспрессированной в .i, из рас вора тубулина
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Возможно, связывание мРНК с микрофиламентами происходит за счет основного белка мРНП р, для которого также показано взаимодействие актином v . Роль микротрубочек в иммобилизации компонентов трансляционною аппарата в настоящий момент исследована недостаточно. Дя трансляции большинства клеточных мРНК наличие интактных микротрубочек не существенно, поскольку их разрушение нокодазолом не приводит к значительному понижению общего синтеза белка . Однако для трансляции некоторых мРНК наличие микротрубочек необходимо. Было показано, что транслирующаяся мРНК ранних генов вируса коровьей оспы локализуется в цитоплазме зараженных клеток в виде отдельных гранул, расположенных на микрорубочках. Ассоциация вирусных мРНК с микротрубочками не блокировалась циклогексимидом, предотвращающим синтез вирусных белков, что указывает на наличие клеточных белков, определяющих связывание мРНК вируса с микротрубочками i, . Возможно, это означает наличие в клетке какихто определенных мРНК, для трансляции которых необходима их ассоциация с микротрубочками. Специфическая локализация некоторых мРНК в определенных областях цитоплазмы характерна в основном для клеток, обладающих отчетливо выраженной поляризацией цитоплазмы. К таким клеткам относятся нейроны и ооциты. В ооцитах специфическая локализация мРНК крайне важна для правильного протекания морфогенетических событий в раннем эмбриогенезе. В ооцитах дрозофилы локализация мРНК показана локализация мРНК ii. РНК располагается в передневерхней области оонита , . В ооцитах ксенопуса показана локализация В ооцитах ксенопуса показана специфическая локализация мРНК V и X2 на вегетативном полюсе i, . Специфическая локализация некоторых мРНК показана также для астроглиальных и нервных клеток. В нейронах показана специфическая локализация семи различных мРНК. В дендритах локализуется мРНК МАР2, i. РНК i, , мРНК схсубъединицы Са2кальмодулинзависи. II i i. РНК усубъединицы прогеинкиназы РКС i , , мРНК рецептора I3 ii , и мРНК рецептора глицина Касса i. Такая локализация опосредуется рядом мРНКсвязывающих белков, которые специфически взаимодействуют с последовательностями этих мРНК и белками цитоскелета. РНК в определенной области цитоплазмы, и транзиторным, опосредованном моторными белками и необходимым для активного транспорта локализованной мРНК в место локализации. Возможно, что большинство мРНК, имеющих выраженную локализацию в цитоплазме, достигают места локализации за счет активного транспорта. Во всяком случае, если существую данные о способе достижении мРНК места своей локализации, то они свидетельствуют именно о механизме активного транспорта такой мРНК в область локализации. Обычно, транспортировка мРНК связана с системой микротрубочек, иммобилизация в области локализации может быть связана как с актиновыми филаментами, так и с микротрубочками. Было показано, что перемещение мРНК V на веретатнвный полюс ооцита зависит от сиситемы микротрубочек, в то время как для закрепление в области локализации необходима система микрофиламентов ii . Дня мРНК в ооцитах дрозофилы также показан транспорт по микротрубочкам за счет активности кинезина I. Транспорт мРНК ii также связан с системой микротрубочек и осуществляется за счет активности динеина. Перемещение мРНК основного белка миелина МВР в олигодендроцигах происходит за счет активности кинезина . РНК в области локализации данные отсутствуют. В нейронах основной транспорт мРНК связан с системой микротрубочек. При наблюдениях за живыми клетками, было показано, что мРНК, собранная в достаточно большие гранулы, перемещается вдоль микротрубочек со скоростями, характерными для активного транспорта . Локализация и транспорт мРНК в неспециализированных клетках исследована мало. Достаточно давно было показано, что мРНК некоторых цитоскелстных белков распределена неравномерно в цитоплазме фибробластов и миобластов. При гибридизации i i было показано, что мРНК актина концентрируется на периферии цитоплазмы и в ламелле, мРНК виментина концентрируется в перинуклеарпой зоне, мРНК тубулииа концентрируется на периферии цитоплазмы i, .