Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов

• Автор: Фролов, Андрей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 с. : ил

1.1. Структура рецептора КТ

1.2. Лиганд рецептора КГГ стволовой фактор роста

1.3. Функции системы I

1.4. Молекулярные каскады, вовлеченные в передачу сигнала рецептором

1.4.1. Каскад Фосфотидилинозитол 3 Киназы

1.4.2. Каскад

1.4.3. киназы

1.4.4. Каскад киназы

1.4.5. МАРК каскад и транскрипционные факторы

1.4.6. Каскад фосфолипазы Су

1.4.7. Каскад с вовлечением адаптерных белков

1.5. Отрицательная регуляция прохождения сигнала КТ
1.5.1. Отрицательная возвратная петля протеинниназы С РКС
1.5.2. Тирозиновая фосфатаза, содержащая гомологичный домен 2
1.6 Эффекты активирующих мутаций сЮТ на трансдукцию сигнала от рецептора внутрь клетки
1.6.1. Активирующие мутации гена I
1.6.2. Последствия активирующих мутаций гена I
1.7. Гливек селективный ингибитор рецепторных тирозиновых
Глава 2. АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА ДНКМИКРОЧИПАХ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ
2.1. Эволюция методов анализа дифференциальной экспрессии
2.1.1. Метод дифференциального дисплея мРНК
2.1.2. Методы вычитающей гибридизации
2.1.3. Серийный анализ экспрессии генов
2.2. Метод гибридизации на ДНКмикрочипах
2.2.1. Производство ДНКчипов
2.2.2. Аспекты экспериментального дизайна
2.2.3. Получение кДНК и гибридизация на ДНКмикрочипах
2.2.4. Детекция гибридизационного сигнала и количественная оценка изображений
2.2.5. Обработка и вскрытие полученных данных
2.3. Применение ДНКмикрочипов в молекулярной онкологии.
2.4. Ближайшие перспективы применения и развития технологии ДНКчипов
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Культура клеток СОЖКТ.
2. Обработка культуры клеток СОЖКТ Гливеком и оценка пролиферации и апоптоза.
3. Анализ состояния клеточного цикла.
4. Выделение суммарной фракции РНК.
5. Производство ДНКчипов.
6. Приготовление и гибридизация зондовой кДНК смеси.
7. Расчет интенсивности сигнала и математическая обработка данных.
8. Аннотация и секвенирование кДНК клонов.
9. Нозерн блоттинг анализ.
. Обратная транскрипция РНК.
. Полимеразная цепная реакция.
. Обработка клеток СОЖКТ ингибитором МЕК и ингибитором I3.
. Получение полноразмерной кДНК гена x, присоединение мусэпитопа и клонирование в экспрессирующий
лентивирусный вектор.
. Экспрессия трансгена x с использованием
лентивирусной системы экспрессии.
. Дизайн и производство поликлональных антител к белку 4.
. Приготовление клеточных лизатов, белковый электрофорез и Вестерн блоттинг.
. Клинические образцы и биоптаты СОЖКТ.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание модели стромальных опухолей желудочнокишечного тракта л vi.
2. Выявление маркеров эффективности лечения Гливеком стромальных опухолей желудочнокишечного тракта СОЖКТ и молекулярные механизмы его фармокодинамики.
2.1. Эффект лекарственного воздействия Гливека на рост и пролиферацию клеток СОЖКТ в системе i vi.
2.2. Профилирование экспрессии генов в культуре клеток СОЖКТ, обработанных Гливеком, с использованием кДНК чипов.
3. Ингибирование рецептора I Гливеком в клетках I2.
4. Регуляция экспрессии Гливекзависимых генов 4, x и 2 осуществляется I2зависимым путем.
5. Определение значимости генов БРПУ4А и МАЯЬх как непрямых маркеров ответа на Гливек в клинических образцах СОЖКТ.
6. Анализ экспрессии СК1Т, АКТ и ЕРК в СОЖКТ резистентной к Гливеку.
7. Экспрессия трансгена МАРЬх вызывает нарушение пролиферации клеток СОЖКТ.
8. Только ген вРЯУ4А из семейства генов Эргои1у подвергается репрессии в клетках 8Т2, обработанных Гливеком.
9. Получение поликлональных антител к 8РВУ4 позволило выявить снижение уровня этого белка после обработки клеток Т2 Гливеком.
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


Получить стабильную культуру клеток, моделирующую СОЖКТ i vi и пригодную для изучения терапевтического воздействия Гливека. Оценить эффект Гливека на рост и пролиферацию полученной культуры клеток с использованием современных методов оценки состояния клеточного цикла, выживаемости, уровней пролиферации и апоптоза. Подтвердить биологическую и клиническую значимость маркерных геновкандидатов в условиях i viv, используя операционный материал и биопсии больных СОЖКТ. Провести функциональную оценку механизмов действия белковых продуктов маркерных генов и вычленить функционально активные молекулярные каскады прохождения сигнала от рецептора I при его активации и ингибировании в контексте СОЖКТ. Все представленные в работе результаты имеют научную новизну. Полученная в настоящей работе клеточная линия I2 является первой описанной стабильной культурой клеток СОЖКТ. Эта клеточная линия впервые использована нами как модель СОЖКТ для изучения биологии этого новообразования. Получив препарат Гливек с любезного разрешения компании Новартис Онкология, мы имели возможность в рамках клинических испытаний впервые исследовать действие Гливека на культуре клеток I2. Впервые всесторонне оценено действие Гливека на рост, пролиферацию клеток СОЖКТ и индукцию в них апоптоза, равно как на состояние и взаимодействие каскадов прохождения сигнала от рецептора I и на уровни экспрессии других генов. Нами впервые проведено генетическое профилирование ответа на действие Гливека в системе СОЖКТ i vi. Гливека подтверждено двумя независимыми методами. Эффект резкого изменения экспрессии двух генов 4 и под действием Гливека наблюдали также в клинических биопсийных образцах опухолей больных СОЖКТ, что является принципиально новым результатом. Впервые показано, что инсерционная соматическая мутация гена I i6 определяет резистентность к Гливеку. Молекулярные механизмы эффектов Гливека также впервые подробно исследованы на уровне белков. Гливек в лечении СОЖКТ. В ходе этих испытаний от пациентов до и после терапии Гливеком был получен уникальный набор биопсий СОЖКТ, который использовался в данной работе. На этих клинических образцах, как в случае благоприятного ответа на терапию Гливеком, так и в случае резистентных СОЖКТ, подтверждена биологическая значимость полученных в культуре клеток результатов. Анализ экспрессии генов, определяющих эффективность ответа на Гливек, позволил найти прогностические маркеры результативности лечения Гливеком, которые можно определять даже в тонкоигольных биоптатах СОЖКТ. Выявленные маркеры являются высоконадежными действительно, предсказание совпадало с клинической картиной в 0 случаев. Разработанная модель СОЖКТ i vi имеет большую практическую ценность, поскольку может быть использована для поиска потенциальных маркеров лекарственной эффективности других препаратов. СОЖКТ, резистентной к Гливеку. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ПЕРЕАЧА СИГНАЛА РЕЦЕПТОРОМ КТ И ЕГО БЛОКАДА СЕЛЕКТИВНЫМ ИНГИБИТОРОМ ТИРОЗИНОВЫХ КИНАЗ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ПРЕПАРАТОМ ГЛИВЕК. Протоонкоген i был открыт как клеточный гомолог онкогена vi, полученного из ретровируса 4 саркомы кошачьих и вызывающий образование мультицентрической фибросаркомы 1. Этот протоонкоген кодирует трансмембранную рецепторную тирозиновую киназу РТК III типа с молекулярным весом кДа, обладающую высоким сродством и структурной гомологией с другими членами семейства тирозиновых киназ, таких как рецептор тромбоцитарного фактора роста 2 и рецептор колониестимулирующего фактора роста 1 или 3. У человека, I расположен на хромосоме 4 4 и находится вблизи генов, кодирующих и рецептор эпидермального фактора роста 4. Результатом альтернативного сплайсинга гена I являются две встречающиеся изоформы, одна из которых содержит 4 аминокислотных остатка в положении 0 i А, а другая их не содержит i. Положение этих аминокислот находится в непосредственной близости от трансмембранного домена рецептора 5. Биологическая значимость этих изоформ до сих пор остается неизвестной, но показано, что обе изоформы одновременно сосуществуют в отношении i i и это отношение претерпевает значительное изменение в процессе онкогенеза.