Реконструкция трансляционных инициирующих комплексов на эукариотических мРНК со структурированными 5'-нетранслируемыми областями

• Автор: Дмитриев, Сергей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 91 с. : ил

Содержание.

Список сокращений.

Введение

Обзор литературы

Глава 1. Механизмы инициации трансляции у эукариот

1.1 Особенности эукариотических мРНК.

1.2 Сканирующая модель инициации трансляции

1.3 Влияние вторичной структуры мРНК

на инициацию трансляции

1.4 Факторы инициации трансляции

1.4.1 Факторы, ассоциированные с 4 ОБ субчастицей.

е1РЗ .
е1ПА.
1.4.2 Факторы, участвующие
в привлечении мРНК в инициаторный комплекс.
I4 и его компоненты.
еР4В
Прочие белки, участвующие в преодолении
вторичных структур мРНК
1.4.3 Факторы, участвующие в
присоединении Б субчастицы.
е1Г5В
Прочие белки, участвующие в инициации
на стадии Б
1.5 Современная модель
и перспективы изучения инициации трансляции
Глава 2. Метод реконструкции инициаторных комплексов из очищенных компонентов
и техника тоупринтинга
Результаты и обсуждение
1. Наличие в 5НТО мРНК даже незначительного числа спаренных оснований приводит к неэффективности сборки
при использовании стандартного протокола
2. Фактор инициации е1Г4В критичен для реконструкции Б комплексов с мРНК, имеющими в 5НТО незначительные вторичные структуры
3. Фактор инициации е1Б4Н не может заменить е1Б4В в системе реконструкции Б комплексов с мРНК, имеющими в 5НТО незначительные вторичные структуры.
4. Эффективная реконструкция 4 8Б комплексов с мРНК, содержащими полный трипартитный лидер
и 5НТО мРНК рактина.
5. Незначительные вариации вторичной структуры 5НТО изменяют требования мРНК к концентрации
фактора инициации е1Р2.
6. Изучение перехода Б инициаторного комплекса
в 3 комплекс методом тоупринтинга.
Материалы и методы
1. Реактивы и материалы
2 . Плазмидные конструкции
3. Генноинженерные манипуляции.
4. Получение РНКтранскриптов
5. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика
6. Сборка инициаторных комплексов
в лизате ретикулоцитов кролика.
7. Зондирование вторичной структуры мРНК
8. Реконструкция инициаторных комплексов из очищенных компонентов
8.1. Выделение рибосомных субчастиц
и факторов инициации.
8.2. Аминоацилирозание инициаторной тРНК.
8.3. Собственно сборка инициаторных комплексов.
8.4. Тоупринтинг.
8.5. Анализ комплексов методом центрифугирования
в градиенте сахарозы.
9. Количественная обработка результатов.
Благодарности.
Список использованной литературы


Метод блестяще проявил себя при исследовании внутренней инициации на мРНК некоторых вирусов. Однако его применение к изучению кепзависимой инициации до сих пор привело к успешной реконструкции Б и в инициирующих комплексов лишь на мРНК 3глобина и на искусственной матрице с СААПлидером. Все попытки добиться сборки на других кепзависимых мРНК как в нашей, так и в других лабораториях заканчивались неудачей, несмотря на то, что эти мРНК в частности, мРНК 3актина, поздняя аденовирусная мРНК, мРНК белка теплового шока Нзр и ряд других прекрасно транслируются в клеточном лизате. В ходе данной работы было показано, что сложности в реконструкции инициирующих комплексов на таких мРНК определяются наличием в их 5НТО вторичных структур, причм даже незначительное количество спаренных 6Соснований приводит к снижению выхода 8комплекса. Было проведено исследование с использованием модельных конструкций, показавшее, что наличие в блидерах мРНК незначительных вторичных структур резко повышает требования к концентрации фактора инициации е Р4В, который, будучи очищен до гомогенного состояния, становится очень нестабильным и быстро теряет активность даже при хранении в глубокой заморозке, чем и объяснялись предыдущие неудачи в реконструкции. У таких матриц также наблюдались повышенные требования к факторам е1Р4Б, е1Б4А и е1Б2. С учтом этих данных начальная методика реконструкции 8комплексов из очищенных компонентов была модифицирована, в результате чего впервые удалось добиться сборки Э на кепзависимых мРНК со структурированными бНТО и продемонстрировать правильность положения 8 субчастицы на А1Юкодоне методом тоупринта. Другая часть работы была посвящена применению метода тоупринта для анализа различий между в и 8 инициирующими комплексами. Было обнаружено, что паттерны тоупринтов от Б и Б комплексов как в лизате ретикулоцитов кролика, так и в системе реконструкции из очищенных компонентов различаются, что позволило изучить накопление комплексов в лизате под действием разных антибиотиков, обнаружить паузу в переходе Б в Б и проанализировать распределение комплексов на трх А1Юкодонах вируса энцефаломиокардита. Глава 1. Механизмы инициации трансляции у эукариот. Особенности эукариотических мРНК. РНК эукариот, закодированные в ядре, имеют некоторые черты, отличающие их от прокариотических мРНК и мРНК клеточных органелл. К структурным особенностям эукариотических мРНК в первую очередь следует отнести наличие кепа на бконце и длинного полиАтракта на Зконце. Кеп это особая посттранскрипционная или, скорее, котранскрипционная модификация, представляющая собой, в большинстве случаев, метилированный по 7му положению гуанозин, присоединнный к мРНК посредством ббтрифосфатного мостика 1, 2. Кроме того, 2гидроксильные группы рибозы в самом кепе и в первых одном или двух основаниях мРНК также, как правило, метилированы. Полиадениловый тракт является второй котранскрипционной модификацией 3, 4, однако, в отличие от кепа, он имеется не у всех мРНК, и длина его, составляющая в среднем около 0 нуклеотидов, может быть различной у разных мРНК, а также меняться во времени у одной и той же матрицы 5. Справедливости ради стоит заметить, что короткие олигоАстретчи есть и у многих прокариотических мРНК 6, однако только у эукариот эта модификация получила ярко выраженную функциональную нагрузку, бкеп и ЗполиА значительно увеличивают эффективность трансляции мРНК, оказывая синергичное действие 15, 7, 8. Кроме того, эти структуры принимают участие в сплайсинге, экспорте из ядра, цитоплазматическом транспорте, регуляции стабильности мРНК и ткане и стадиеспецифичном трансляционном контроле 9. Такое разнообразие функций объясняется тем, что именно эти элементы мРНК в первую очередь распознаются специальными белками см. РНКметаболизма. Тем не менее, они не являются абсолютно необходимыми для правильной трансляции матрицы не только i vi, но и i viv 14,. Инициаторным кодоном в эукариотических мРНК является почти исключительно .