Функциональная характеристика ретроэлемента Penelope Drosophila virilis

• Автор: Пятков, Константин Иванович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩНИИ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классы мобильных элементов i.

1.2. Ретротранспозон и его роль в возникновении синдрома гибридною дисгенеза у i viii.

1.2.1. Структура ретроэлемента

1.2.2. Обратная транскриптаза сильно дивергировала от обратных транскриптаз других ДКПнесодержаших ретроэлементов
1.2.3. кодирует предсказанную нуклеазу, подобную v и эндонуклеазам, содержащим I мотив

1.2.4. Ретроэлемент и его возможное участие в эволюции видов группы viii.

1.3. Межвидовая трансформация насекомых.

1.3.1. Методы введения экзогенной ДНК в геном насекомых
1.3.2. Использование мобильных элементов в качестве векторов для трансформации насекомых
1.3.2.1. элемент
1.3.2.2. Элементы и .
1.3.2.3. Элементы и Нi 1.
1.2.3.4. Элемент i.
1.3.3.5. Элемент i
1.3.3. Использование вирусов в качестве векторов при трансформации насекомых .
1.3.3.1. ii альфавирус.
1.3.3.2. Пантропические ретровирусы.
1.3.4. Трансформация насекомых и выбор вектора.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Штаммы бактерий
2.1.2. Среды и основные буферы
2. ГЗ.Олигонуклеотидные праймеры
2.1.4. Материалы и реактивы.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК.
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК в неденатурирующих условиях.
2.2.3. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.2.4. Фосфорилирование олигонуклеотидных праймеров.
2.2.5. Препаративное выделение фрагмента ДНК
2.2.6. Выделение мРНК из мух
2.2.7. Лигирование фрагментов ДНК.
2.2.8. Получение компетентных клеток .i и их трансформация
2.2.9. Анализ рекомбинантных клонов.
2.2 Элеюгрофорез белков.
2.2 Определение концентрации белка
2.2 Определение первичной последовательности ДИК
2.2 Получение высокомеченой РДНК методом случайного праймера
2.2 Выделение геномной ДНК из мух.
2.2 Гйбридизация политенных хромосом i i
2.2 Очистка обратной транскриптазы .
2.2 Определение активности обратной транскриптазы.
2.2 Определение эндонуклеазной активности
2.2 ДНКДНК гибридизация по Саузерну
2.2 Иммунологическая реакция
2.2 Культивирование i.
2.2 элемент зависимая трансформация .
2.2 Анализ белковых последовательностей.
2.2 Получение антител
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика экспрессии i viv и i vi.
3.1.1. Клонирование и экспрессия фрагмента ОРС
3.1.2. Определение экспрессии i viv.
3.1.3. Определение структуры и последовательност и кДНК в дисгенных гибридах . viii
3.1.4. Клонирование ОРС в бакуловирусном векторе, экспрессия в культуре клегок i
3.1.5. Очистка белка
3.1.6. Биохимические свойства обратной транскриптазы
3.1.7. Тестирование нуклеазной активности, кодируемой ОРС
3.1.7.1. Определение последовательности двух сайтов интеграции .
3.2. Введение элемента в геном
3.2.1. Получение конструкций, содержащих МЭ для интеграции в
3.2.2. Анализ трансформированных линий при помощи блота по Саузерну и гибридизация i i.
3.2.3. Определение структуры 5фрагмента кДНК в трансформированных линиях .
3.2.4. ПЦР анализ трансформированных линий.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


С другой стороны, накоплен богатый экспериментальный материал по использованию МЭ в качестве удобного орудия для манипуляции с генетическим материалом, введения чужеродной ДНК в геном и получения мутаций. Ретротранспозон является особым элементом i viii в силу того, что он отвечает за мобилизацию других неродственных семейств транспозонов, наблюдаемую при дисгенезс у этого вида vv . Мобильный элемегт имеет сложную, очень варьирующую организацию у всех изученных видов группы viii Евгеньев и др. ОРС. Как правило, с обоих концов элемент фланкирован короткими прямыми повторами vv . I , , vi . Филогенетический анализ МЭ свидетельствует о том, что этот элемент не принадлежит ни к одному из известных классов ретроэлементов, а формирует отдельное, возможно, древнее семейство ретротранспозонов Евгеньев и др. В настоящее время функционально не охарактеризован ни один из элементов, принадлежащих к этому семейству МЭ, поэтому, изучение структуры и энзиматических активностей кодируемою им белка является актуальным исследованием. Работа в этом направлении необходима для формирования современных представлений о молекулярных механизмах, обеспечивающих перемещение данного ретротранспозона в геноме, и взаимосвязи его с другими мобильными элементами, перемещение которых наблюдается при дисгенезе у . Дели и задачи исследования. Цель настоящей работы изучение экспрессии МЭ и определение энзиматических активностей кодируемого им белка. МЭ в юном . Работа выполнена в Лаборатории Молекулярные основы эволюции Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН в соогвегствии с планом научноисследовательских работ лаборатории. Научная новизна. Проведен онтогенетический анализ экспрессии мобильною генетического элемента i viii. III стадия и яичниках родительской линии i viii, содержащей элемент . Определена последовательность и структура полноразмерного транскрипта . Установлено, что транскрипт имеет длину нуклеотидов, содержит единственную открытую рамку считывания размером п. Показано, что из 5 нстранслируемой области транскригтга вырезается интрон размером нуклеотидов. Получен рекомбинантный бакуловирус, содержащий ОРС , с помощью которого данная ОРС экпрессирована в клетках i. Белок очищен последовательной хроматографией на фосфоцеллюлозе Р , гепаринсефарозе i и , i. Экспериментально показано, что очищенный белок является Мп2зависимой обратной транскритттазой. Установлено, что продукт экспрессии ОРС элемента также обладает эндонуклеазной активностью. Методом элемент зависимой трансформации регротранспозон введен в геном i . Показано, что в трансформированных линиях . Результаты по клонированию и экспрессии ОРС , выявлению и характеристике обратнагранскриптазной активности белка , определению экспрессии элемента i viv, определению последовательности транскрипта , введению в геном . Полученные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством функциональной активности МЭ . Впервые обнаружено перемещение ретротранспозона в геноме другого вида. Представленные в работе нуклеотидные последовательности полноразмерного транскринта , сайтов интеграции в геном . Практическая ценность результатов работы. Настоящая работа является частью фундаментальных исследований, посвященных изучению мобильных генетических элементов i viii. Научнопрактическое значение работы состоит в том, что в ней получены результаты, углубляющие понимание механизма транспозиции нового семейства ретроэлементов. Результаты настоящей работы могут быть использованы при конструировании модельных сисгем для изучения синдрома гибридного дисгенеза, а также при создании векторов для межвидовой трансформации насекомых. Определение экспрессии мобильного элемента i viv. Определение структуры и последовательности транскрипта элемента . Создание рекомбинантного бакуловируса, содержащего ОРС . Выделение, очистка белка и биохимическая характеристика его обрат нотранскриптазной активности. Определение нуклеазной активности продукта экспрессии ОРС . Введение мобильного элемента в геном i . Способность элемента транскрибировался в трансформированных линиях .