Создание векторных конструкций, содержащих гены фунгицидно-бактерицидных пептидов, и анализ полученных с их помощью трансгенных растений

• Автор: Сердобинский, Леонид Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Плазмиды АгоЬаОепит как векторная система для введения

гетерологичиых генов в высшие растения.

1.1. Плазмиды агробактерий и опухолеобразование у высших растений.

1.2. Процесс переноса ТДНК из агробактерии в растительную

1.3. Интеграция ТДНК в геном растения.

1.4. Конструирование бактериальных векторов для введение генов в

растения

1.4.1. ТДНК как природный экспрессионный вектор.

1.4.2. Коинтегративные векторы и бинарные векторы
1.4.3. Маркерные гены
1.4.4. Промоторы.
Глава 2. Антимикробные белки и их использование для защиты растений.
2.1. Классификация антимикробных белков
2.2. Растительные дефензины
2.2.1. Структура растительных дефензинов.
2.2.2. Экспрессия дефензинов в органах растений
2.2.3. Антимикробные свойства растительных дефензинов
2.2.4. Механизм действия растительных дефензинов.
2.3. Антимикробные белки амаранта
2.3.1. Структура хитинсвязывающих белков амаранта
2.3.2. Антимикробная активность белков амаранта
2.4. Получение трансгенных растений с генами антимикробных белков
2.4.1. Трансгенные растения, устойчивые к патогенным бактериям.
2.4.2. Транстенные растения, устойчивые к грибным патогенам
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы ,
3.1. Методы молекулярного клонирования в бактериях
3.1.1. Бактериальные штаммы и используемые среды
3.1.2. Клонирование плазмидной ДНК в агробактериях ,
3.1.3. Анализ клонированных генов ,
3.2 Методика получения трансгетшых растений табака
3.3. Методы анализа трансгенных растений
3.3.1 Выделение растительной геномной ДНК ,
3.3.2. Полимеразная цепная реакция ПЦР
3.3.3. Блотгибридизация растительной ДНК по Саузерну
3.3.4. Реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР ОТПЦР .
3.3.5. Иммуноферментный анализ Вестернблоттинг трансгенных растений
с геном г 8ар
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 4. Создание векторных конструкций с генами антимикробных белков
4.1. Создание векторной конструкции с геном амаранта асар
4.2. Создание векторных конструкций с геном редьки гэар
Глава 5. Анализ полученных трансгенных растений табака с генами
антимикробных белков редьки и амаранта
5.1. Определение эффективности трансформации табака при помощи
созданных векторных конструкций с генами антимикробных белков
редьки и амаранта
5.2. Изучение наследования генов гэар и асар в поколении т.
трансгенных растений табака ,
5.3. Изучение транскрипции и трансляции встроенных генов г 8ар и асар
в поколениях Т0 и трансгенных растений
табака
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А.к. аминокислота
Т.п.н. кВр тысяча пар нуклеотидов
ЭДТА динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
СТАВ цетилдиметилэтиламмониумбромид
ВМЕ рмеркаптоэтанол
8 додецилсульфат натрия
ТВБТ триствиновый буфер
ИМК индолилмасляная кислота
ПААГ полиакриламидный гель
БСА бычий сывороточный альбумин
Кт канамицин
пр ген неомицинфосфотрансферазы
ОСБ ген октопинсинтазы
ген нопалинсинтазы
ВМЦК вирус мозаики цветной капусты
УФ ультрафиолетовый
1С концентрация белка для подавления роста гриба на .
АБК абсцизовая кислота.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Интенсивное изучение структуры и функций антимикробных пептидов, исследование их генетической обусловленности может помочь в создании методами генной инженерии трансгенных культурных растений, устойчивых к различным заболеваниям. Создание траисгенных растений, устойчивых к фитопатогенам, является в последние годы одним из главных направлений генпой инженерии культурных растений. Это достигается главным образом путем введения в них чужеродных генов, кодирующих защитные белки, накопление которых в тканях растений губительно для патогенов. Однако большинство известных защитных генов могут придавать устойчивость к одному или нескольким патогенам. В связи с этим, для защиты растений от патогенных грибов и бактерий очень перспективны гены, отвечающие за синтез пептидов, обладающих широким спектром фунгициднобактерицидного действия. К таким белкам принадлежат короткие цистеинбогатые белки, получившие название дефензины от англ. В растениях дефензины были открыты в году ii , , . Дефензины обнаружены у многих представителей таких важных для сельского хозяйства семейств, как Злаки, Крестоцветные, Сложноцветные, Бобовые, Пасленовые и других. Растительные дефензины новый класс антимикробных пептидов, проявляющих структурную и функциональную гомологию с их двойниками у животных дефензинами насекомых и млекопитающих, чье участие в защите организма хорошо установлено. Для хитинсвязывающих белков также показана ингибирующая активность по отношению к патогенным микроорганизмам, а также насекомым. Положительным моментом в характеристике этих белков является то, что они воздействуют на патогены в микромолярных количествах мкгмл. Среди известных на сегодняшний момент растительных дефензинов высокой антимикробной активностью обладают дефензины редьки в частности 2, 3, а среди хитинсвязывающих белков белки амаранта АсАМР2 . . Поскольку эти пептиды короткие и состоят из а. Такая организация значительно облегчает процессы клонирования этих генов и трансформации ими растений. В последнее время достаточно остро стоит вопрос биобезопасности в отношении получаемых генетически модифицированных организмов ГМО будут ли данные организмы опасны при попадании в окружающую среду и в качестве пищи для человека В связи с этим необходимо отметить, что отличительной особенностью дефензинов редьки и антимикробных белков амаранта является то, что они не проявляют токсического действия на клетки животных и человека , а, . Все выше сказанное о белках из редьки и амаранта предполагает возможность эффективного, а главное безопасного применения генов этих белков для трансгеноза важнейших сельскохозяйственных культур. Агробактериальная трансформация известна как наиболее оптимальный способ введения чужеродных генов в двудольные растения. В связи с этим, достаточно актуальна проблема создания генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень трансформации и экспрессии целевого гена. От патогенов в большей степени страдают вегетативные органы растений. Поэтому экспрессия в них генов антимикробных белков, особенно обладающих более высокой физиологической активностью пептидов из других растений, должна способствовать появлению необходимой устойчивости к патогенам у всего растения. Нужно отметить, что несмотря на достаточную изученность строения и свойств антимикробных белков редьки и амаранта, в настоящее время насчитывается небольшое количество работ по получению растений экспрессирующих эти белки . . , . В связи с вышеизложенным, настоящая работа посвящена анализу полученных при помощи ПЦР амплификации в лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ геномных копий асар и , кодирующих хитинсвязывающий белок амаранта и дефензин редьки соответственно, созданию векторных конструкций с этими генами для проведения агробактериалыюй трансформации растений, а также изучению на модельном растении табаке ii интеграции в геном и функционирования этих генов.