Исследование механизмов импорта тРНК в митохондрии дрожжей и возможности использования этого процесса для лечения некоторых нейромышечных заболеваний человека

• Автор: Колесникова, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил

1. Импорт белков в митохондрии.

1.2. Претранслокационное разворачивание предшественников митохондриальных белков и их транспорт к митохондриальной поверхности

1.3. Транслокационный комплекс внешней митохондриальной мембраны.

1.4. Транслоказы внутренней митохондриальной мембраны

1.4.1. Импорт белков, содержащих классическую сигнальную последовательность

1.4.2. Импорт гидрофобных белков с внутренними сигнальными последовательностями

1.4.3. ОХЛтранслоказа.

2. Импорт тРНК в митохондрии

2.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших

2.1.1. Импорт тРНК вмнтохондрин

2.1.2. Импорт тРНК в митохондрии трипаносоматид

2.2 Импорт в митохондрии растенийи.
2.3. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей.
2.4. Импорт тРНК в митохондрии животных
3. Болезни человека, обусловленные мутациями в митохондриальном геноме.
3.1 Болезни человека, обусловленные мутациями в генах тРНК.
Материалы и Методы исследования.
1. Штаммы микроорганизмов и линии клеток.
1.1. Штаммы ii i.
1.2. Штаммы vii.
1.3. Линии клеток человека.
3. Генноинженерные методы.
3.1. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез ., .
3.1.1. Выращивание урацилсодержащих фагов.
3.1.2. Выделение однонитсвой ДНК из фаговых частиц.
3.1.3. Фосфорилирование олигонуклеотидов.
3.1.4. Отжиг олигонуклеотидов на матрицу.
3.1.5. Синтез комплементарной цепи ДНК.
Оглашение
3.2. Трансформация клеток Е.соИ.
3.2.1 Метод солевой трансформации
3.2.2. Электропорация
3.3. Выделение и очистка однокитевых ДНК фагов для ссквснирования
3.4. Секвестрование одноннтевых и двунитсвых ДНК
3.5. Выделение репликативной формы ДНК рекомбинантных фатов и плазмидных ДНК
3.6. Получение матриц для Т7транскрипции методом РСЯ.
3.6.1. Полимеразная цепная реакция.
3.6.2. Расщепление ДНК рестриктазой
3.7. Г7 транскрипция.
3.8. Амнноацилирование Т7транскриитов 1енатРНК.
3.9. Радиоактивное мечение траискриптов.
3 Связывание РНК и Т7тракскриптов с ргсМ8К
3 Транспорт радиоактивно меченных траискриптов гена тРНК в изолированные митохондрии.
Выделение митохондрий.
Импорт РНК в изолированные митохондрии
3 Импорт Бмечснных траискриптов в изолированные митохондрии
дрожжей
3 Иммунопрсципшация.
3 егпгибридизация
3 Трансформация дрожжей .
3 Выделение суммарных и митохондриальных РНК
3 Выделение аминоацилтРНК в кислых условиях
3 Гибридизация по Нозерну и точечная гибридизация.
3 Обратная транскрипция и амплификация
3 Импорт дрожжевых тРНК в изолированные митохондрии клеток человека
. Выделение митохондрий из клеток человека.
. Импорт дрожжевых тРНК
3 Трансфекция клеток человека в культуре
3 Клонирование клеточных линий методом предельного разведения
3 Выделение суммарной клеточной и митохондриальной тРНК нз клеток человека
Отакчашс
3 Гистохимическое окрашивание клеток для определения активности цитохром С окендазы
3 Оценка скорости поглощения кислорода клетками
3 Биосинтез белка в клетках человека в культуре
Результаты и обсуждение.
1. Влияют ли нуклеотиды аншкодона на зффекшвноегь ее
импорта в митохондрии дрожжей.
1.1. Мутации в антикодонс значительно влияют на аминоацилированис тРНК1.
1.2. Мутации в антикодоне тРНК1 поразному влияют на связывание соответствующих транскриптов с , но практически не сказываются на их способности импортироваться в митохондрии.
2. Учас1вует ли импортируемая тРНЮв митохондриальном биосинтезе белка
2.1. Производные тРКЛга могут импортироваться в изолированные митохондрии дрожжей в мисацнлированной форме
2.2. тРНК. импортируемые в изолированные митохондрии дрожжей, могут принимать участие в митохондриальном биосинтезе белка.
2.3. Импортируемые тРНК принимают участие в митохондриальном биосинтезе белка i viv и способны супреесировать нонсенс мутацию в митохондриальной ДК.
2.4. Импортируемые i viv производные тРНК2 способны сулрсссировзть нонсснс мутацию в митохондриальной ДНК
3. Могут ли тРНК импорт ироваться н митохондрии человека
3.1. Дрожжевые лизиновыс тРНК способны проникать в митохондрии человека i vi.
3.2. Дрожжевые лизнновые тРПК способны проникать в митохондрии человека i v.
4. Способна ли импортируемая в митохондрии лнзинован тРНК
супреесировать мутацию в митохондриальной ДНК.
ВЫВОДЫ
Список цнтнрусхюй литерату ры
Приложение 1. Олигонуклеотиды, использованные в данной работе
Приложение 2. Генноинженерные конструкции созданные и использованные в
ходе данной работы.
Благодарности
Список сокращений
Список сокращений.
аланилтРНКсшгтетаза амнноанилтРНКсинтсгала I комплекс Ii ветвь дигидроуридиловая ветвь тРНК
1 I ii i фракция цитоплазматических белков, направляющих импорт тРНК в изолированные митохондрии Км константа Млхаэлиса
Цитоплазматическая лизилтРНКсшггстаза дрожжей цктоплазматнческая лизнлтРНКсинтетаза дрожжей . vii лизилтРНКсинтстаза метно и и лтРНКс и нтстаз а
ii , , i ii i i
i i i митохондриальная сайтспсцифическая энлорибонуклеаза фактор, стимулирующий импорг белков в митохондрии митохондриальная лизилтРНКсинтетала
предшественник митохондриальной лизилтРНКсннтетазы дрожжей . vii
пуриновые нуклеотиды Ру пиримидиновые нуклеотиды САМ хлорамфеннкол
ТОМ ii гранслоказой внешней митохондриальной мембраны
I i ii транслоказа внутренней митохондриальной мембраны
Тветвь ТТСвствь риботимндиловая ветвь тРНК
импортируемая в митохондрии лизнновая тРНК дрожжей . vii тРИК2 неимпортируемая в митохондрии лизнновая тРНК дрожжей vii тРНКЗ митохондриальная лизнновая тРНК дрожжей . xii тр транскрипт
Виедгние
Введение


Сигнальные последовательности узнаются специфическими рецепторами, ассоциированными с транслоказой внешней митохондриальной мембраны ТОМ от англ. Пройдя через внешнюю мембрану, белки направляются к одной из двух транслоказ внутренней митохондриальной мембраны I от англ. Транслокззы внешней и внутренней митохондриальных мембран образуют независимые структурные и функциональные единицы. Общая схема импорта белков представлена на Рисунке 1. Сигнальные последовательности белковых предшественников. Известно два основных типа сигнальных последовательностей отщепляемые и неотщепляемые. Наличие той или иной сигнальной последовательности определяет дальнейшую судьбу импортируемого белка. В зависимости от типа сишапьной последовательности белки направляются в один из четырех субмитохоидриальных компартментов. Классическая сигнальная последовательность, представляющая собой концсвую часть молекулы предшественника направляет белок в матрикс митохондрий. Будучи ковалентно сшитой с неимпоргируемым белком, она придаст последнему способность проникать через обе митохондриальные мембраны в vi . Как правило. Рисунок 1. Два основных пути импорта белков в мнтохонлрии. Белки с отщепляемой сигнальной последовательностью красные и белки с внутренними сигнальными последовательностями синие узнаются рецепторами транслоказы внешней митохондриальной мембраны ТОМ и импортируются в межмембраннос пространство через I комплекс. Белки с отщепляемой сигнальной последовательностью транспортируются через внутреннюю митохондриальную мембрану комплексом I в матрикс, где происходит отщепление сигнальной последовательности пептидазой МРР. Белки с внутренними сигнальными последовательностями взаимодействуют в межмембранном пространстве с малыми Тш белками и встраиваются во внутреннюю мембрану митохондрий посредством комплекса Т1М. Стадия импорта через внутреннюю митохондриальную мембрану в обоих случаях требует наличия потенциала на мембране АТ. Обор литературы. Раньше предполагалось, что такие свойства сигнальной последовательности способствуют ее узнаванию рецептором на внешней митохондриальной мембране и облегчают ее прохождение через мембраны. Последние данные свидетельствуют о том, что разные рецепторы ТОМ узнают разные поверхности сигнальной последовательности положительнозаряженная сторона узнается рецептором Тош, а гидрофобная Тош ix . Большая часть концсвых сигнальных последовательностей белков, импортируемых в матрикс, отщепляется, однако у ряда белков они сохраняются. Так, например, шаперонин синтезируется с аминоконцевой сигнальной последовательностью, которая остается в зрелом белке после импорта i . А у митохондриальной ДНКхеликазы дрожжей сигнальная последовательность была обнаружена на Сконцс . В отличие от остальных белков, импортирующихся в направлении С, этот белок проникает в митохондрии С концом вперед. Помимо классической отщепляемой сигнальной последовательности, существуют, так называемые, внутренние сигнальные последовательности. Они характерны для белков, импортирующихся к митохондриальным мембранам или в межмсмбраннос пространство. Некоторые внутренние сигнальные последовательности включают участок положительнозаряженных аминокислот, по структуре напоминающий концевую сигнальную последовательность, но содержат так же гидрофобный участок, специфически препятствующий проникновению предшественника через внешнюю или внутреннюю мембраны так называемый сигнал i . Этот сигнал не просто задерживается в липидной фазе мембран благодаря своим гидрофобными свойствам, но, повидимому, специфически узнается комплексами ТОМ и ГМ . Некоторые белки внутренней митохондриальной мембраны содержат классическую отщепляемую сигнальную последовательность, за которой следует гидрофобный участок, закрепляющий зрелый белок в мембране . Наконец, ряд белков внутренней мембраны содержат от трех до шести сигнальных участков, распределенных по всей длине белка i . Эти сигналы могут не содержать положитсльнозараяжснных аминокислот. По всей видимости, они кооперативно взаимодействуют с рецепторами митохондриальных мембран.