Изучение структурно-функциональной организации фибрилларина человека

• Автор: Левицкий, Сергей Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

Оглавление
Введение

Роль фнбрилларина в биогенезе рибосом и жизнедеятельности клстки.Обзор литературы.

Введение.
Структура и функции ядрышка в клетке. Созревание рРНК. Модификации рибонуклеотидов в прерРНК. Малые ядрышковые РНК.

Фибрнлларин. Общие сведения.

Структурная организация фнбрилларина человека и его отдельных участков.

Ортологи фнбрилларина у архсбактерий. Консервативность структуры и функций.

Роль структурных доменов фнбрилларина в его специфической локализации в ядрышке.

Функции фнбрилларина в эмбриогенезе.

Фибрнлларин как антиген при аутоиммунных заболеваниях.

Рекомбинантные фибрилларины. Роль остатков цистеина в иммуногенности фнбрилларина.
Выводы.
Материалы и методы.
Материалы.
Реактивы.
Ферменты
Бактериальные штаммы и плазмиды.
Микробиологические среды.
Линии клеток человека и среды для эукариотических клеток.
.2. Методы.
И.2.1. Выделение плазмндной ДНК методом щелочного лизиса.
.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции .
.2.3. Олигонуклеотиды.
.2.4. Сайтнаправленный мутагенез.
И.2.5. Получение компетентных клеток . i.
.2.6. Трансформация компетентных клеток . i.
.2.7. Скрининг рекомбинантных клонов.
.2.8. Выделение рекомбинантного белка.
.2.9. Ренатурация очищенного рекомбинантного белка.
.2 Инъекция мышей препаратом белка и отбор крови.
.2 Иммунодот.
.2 Иммуноблот.
.2 Трансфекция клеток и иммуноцитохимичсскис методы.
.2 Выявление мест синтеза рРНК.
III. Изучение структурнофункциональной организации
фнбрилларина человека. Обсуждение результатов.
III. 1. Структурная организация фнбрилларина человека и связь его функциональной активности с локализацией в ядрышках.
1.2. Локализация химерного белка фнбрилларин аналогична распределению эндогенного фнбрилларина.
1.3. Остатки цистеина и 8 и наличие дисульфидной связи между ними не влияют на специфическую локализацию фнбрилларина.
1.4. Конструирование плазмидных векторов для изучения локализации мутантных вариантов фнбрилларина, слитых с в клетках человека.
1.5. домен фнбрилларина содержит сигналы ядрышковой локализации.
Ш.6. Другие структурные участки фибрилларина по отдельности не
содержат сигналов локализации в ядрышке.
1.7. Лишенный ОАЯдомена фибрилларин локализуется
аналогично фибрилларину дикого типа.
1.8. Первый спсйсерный участок играет важную роль в
структурнофункциональной организации фибрилларина человека.
Ш.9. Предполагаемый механизм специфического фибрилларин
зависимого 20метилирования остатков рибозы в прерРНК.
III. . Получение рекомбинантного белка стрептавидин 2й
спейсерный участок аспиральный домен.
III. . Получение и исследование поликлональной сыворотки мыши
к Сконцсвому фрагменту фибрилларина человека.
IV. Выводы.
Благодарности
Список цитированной литературы


Локализация химерного белка фнбрилларин аналогична распределению эндогенного фнбрилларина. Остатки цистеина и 8 и наличие дисульфидной связи между ними не влияют на специфическую локализацию фнбрилларина. Конструирование плазмидных векторов для изучения локализации мутантных вариантов фнбрилларина, слитых с в клетках человека. домен фнбрилларина содержит сигналы ядрышковой локализации. Ш.6. Ш.9. РНК. III. III. Сконцсвому фрагменту фибрилларина человека. IV. Выводы. Список цитированной литературы. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ. этилендиаминтетраацетат натрия. бромистый этидий. зеленый флуоресцирующий белок, i. I изопропилр,0тиогалактопира1юзид. додецилсульфат натрия. РНК малая ядрышковая РНК. РНП малый ядрышковый рибонуклсопротсид. ДНК гены рибосомной РНК. В последнее время в биологии весьма остро стоит вопрос системного познания фундаментальных принципов функционирования клетки. Одним из важнейших процессов в развитии клетки является формирование основного аппарата обеспечения жизнедеятельности клетки биогенез рибосом, без которых развитие, дифференциация и другие процессы жизнедеятельности клеток нереализуемы. Изучение природных механизмов образования аппарата синтеза белка и систематизация знаний об этом процессе может внести существенный вклад в понимание основных принципов функционирования клеток. Актуальность темы диссертации. Прочная взаимосвязь, существующая между функциональной активностью отдельных белков и их внутриклеточной локализацией, позволяет проводить изучение значимости отдельных элементов молекулы для функционирования i viv белка в целом, основываясь, прежде всего, на изменениях в локализации в клетке мутантных полипептидов, детектируемых с помощью методов иммуноцитохимии или флуоресценции слитых с исследуемым продуктом белковмаркеров. Исследование структурнофункциональных отношений в белке ядрышка эукариот фибрилларине, позволяет выявить участки белковой молекулы, определяющие его РНКсвязывающую и метилтрансферазную активности, а также установить структурные элементы, направляющие транспорт этого белка в ядрышко. РНК, позволяют выяснить закономерности распределения фибрилларина в клетке на разных стадиях клеточного цикла, онто и эмбриогенеза. Последнее особенно важно в связи с образованием у ряда больных аутоиммунными заболеваниями например, системной склеродермией антител к фибрилларину и его комплексам с нуклеиновыми кислотами и другими белками. Т.о. Сказанное выше и определяет актуальность темы исследования. Цель работы. Целью работы являлось выяснение функциональной роли отдельных структурных элементов в молекуле фибрилларина человека белка ядрышка эукариот, участвующего в процессинге прсрибосомальной РНК. Научная новизна работы. При проведении работы получена серия рекомбинантных векторов, несущих гены различных мутантных форм фибрилларина человека, слитых с маркерным зеленым флуоресцирующим белком СРР под контролем истинно раннего промотора цитомсгаловируса. Исследована экспрессия генов рекомбинантных химерных белков и изучена локализация мутантных форм фибрилларина человека в клетках НсЬа. Впервые показано, что специфическая локализация фибрилларина в фокусах транскрипции рДНК в ядрышке обусловлена не какимилибо сигнальными последовательностями, а функциональной активностью белка. . Впервые установлено, что наличие или отсутствие дисульфидной связи между двумя высококонсерватнвными остатками цистеина в молекуле фибрилларина человека не влияет на локализацию и функциональную активность белка. Впервые получен рекомбинантный экспрессионный вектор, в составе которого клонирован ген слитого белка стрептавидин Сконцевой фрагмент фибрилларина человека. Показано, что полученная конструкция обеспечивает достаточный уровень экспрессии химерного гена в . Разработана система выделения, очистки и ренатурации такого рекомбинантного белка из штаммапродуцента . Сконцевым фрагментом фибрилларина и полноразмерным фибрилларином в системах i viv и i vi. Практическая ценность работы.