Конструирование и изучение рекомбинантных аденовирусов CELO в экспериментах in vitro и in vivo

• Автор: Шмаров, Максим Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Принятые сокращения.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурнофункциональная организация аденовирусов.

1.1.1. Общая характеристика и классификация

аденовирусов

1.1.2. Структурнофункциональная организация генома аденовирусов.

1.1.3. Особенности структурнофункциональной организации генома аденовируса птиц ГАУ1 СЕЬО.

1.2. Характеристика аденовирусов, как векторов для переноса генетической информации.

1.2.1. Эукариотические векторы на основе аденовирусов человека.

1.2.2. Эукариотические векторы на основе аденовирусов животных и птиц
1.2.3. Эукариотические векторы на основе аденовируса птиц СЕЬО БАУ
1.3. РиСозимы и их использование в качестве терапевтических агентов
1.3.1. Общая характеристика рибозимов.
1.3.2. Рибозимы типа головка молотка ЬапипегЬеай гзЬюгутеэ.
1.3.3 Использование рибозимов в качестве
терапевтических агентов.
Глаза 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ.
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Плазмидные векторы
2.1.4. Ферменты и другие реактивы
2.2. МЕТОДЫ.
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК .
2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеаэами.
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.7. Трансформация клеток .i
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности
2.2.9. Синтез дезоксиолигонуклеотидов
2.2Выделение тотальной РНК из клеточных линий.
2.2 Реакция обратной транскрипции
2.2Полимеразная цепная реакция
2.2Трансфекция клеток линии 3 или для получения рекомбинантных аденовирусов.
2.2Накопление вирусов .
2.2Очистка и концентрирование аденовирусов.
2.2Титрование вирусов .4
2.2Выделение вирионной ДНК.4
2.2Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом4
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ4
3.1. Конструирование рекомбинантного аденовируса птиц СЕЬО4
3.1.1.Создание плазмидной конструкции, несущей
репортерный ген в составе фрагмента генома аденовируса птиц .4
3.1.2.Анализ экспрессии гена в плазмидном векторе
3.1.3.Получение аденовируса методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток . .
3.1.4.Наращивание рекомбинантного аденовируса в куриных эмбрионах
3.1.5.Детекция экспрессии гена в органах и тканях куриных эмбрионах, зараженных рекомбинантным аденовирусом
3.2. Трансдукция различных линий клеток млекопитающих рекомбинантным аденовирусом .
3.3. Трансдукция клеток млекопитающих рекомбинантным аденовирусом i viv
3.4. Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих гены рибоэимов направленных против вируса гриппа.А.
3.4.1.Получение рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса птиц , несущих гены рибоэимов
3.4.2.Тестирование экспрессии генов риСозимов в составе
генома рекомбинантных аденовирусов и в клетках линии А
3.4.3.Получение дефектных рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса человека 5го серотипа с Е1 областью, замещенной генами рибоэимов
3.5. Ингибирование репродукции вируса гриппа А в линии клеток А9, инфицированной рекомбинантными аденовирусами, экспрессирующими гены рибоэимов.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ОГЛАВЛЕНИЕ. Принятые сокращения. Глава 1. Структурнофункциональная организация аденовирусов. Структурнофункциональная организация генома аденовирусов. Особенности структурнофункциональной организации генома аденовируса птиц ГАУ1 СЕЬО. Характеристика аденовирусов, как векторов для переноса генетической информации. Эукариотические векторы на основе аденовирусов человека. Общая характеристика рибозимов. Рибозимы типа головка молотка ЬапипегЬеай гзЬюгутеэ. Глаза 2. МАТЕРИАЛЫ. МЕТОДЫ. Выделение и очистка плазмидной ДНК . Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеаэами. Трансформация клеток . Определение нуклеотидной последовательности
2. Выделение тотальной РНК из клеточных линий. Трансфекция клеток линии 3 или для получения рекомбинантных аденовирусов. Накопление вирусов . Очистка и концентрирование аденовирусов. Титрование вирусов . Выделение вирионной ДНК. Глава 3. Получение аденовируса методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток . Трансдукция различных линий клеток млекопитающих рекомбинантным аденовирусом . Получение рекомбинантных аденовирусов, несущих гены рибоэимов направленных против вируса гриппа. Ингибирование репродукции вируса гриппа А в линии клеток А9, инфицированной рекомбинантными аденовирусами, экспрессирующими гены рибоэимов. Глава 4. ВЫВОДЫ. Принятые сокращения. ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы. В настоящее время аденовирусы Ад хорошо изучены в качестве этиологических агентов различных инфекционных заболеваний человека и животных. Они являются удобной моделью для многочисленных исследований а молекулярной биологии, включая изучение сплайсинга мРНК, репликации ДНК, транскрипции и клеточной трансформации. Аденовирусы широко применяются в качестве векторов для транэиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих i viv и i vi. Исследуется применение векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии. Ад человека эффективно проникают, размер вставки чужеродного генетического материала для аденовирусных векторов первого поколения составляет не более 7,5 т. Ад человека в культуре клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом. В связи с этим возможность создания новых векторных систем на основе геномов аденовирусов животных, в первую очередь птиц, вызывает большой интерес многих исследователей. В последние годы были осуществлены попытки создания векторов на основе Ад животных, в частности на базе генома аденовируса птиц . СЕЬО, чем Ад млекопитающих. При наращивании в куриных эмбрионах выход вируса СЕЬО составляет физических частиц из одного эмбриона, что значительно снижает стоимость получения препаративных количеств вируса. В ряде лабораторий мира проводятся работы по изучению векторной системы на основе генома аденовируса птиц СЕЬО. Цели и задачи исследования. ЬМН. А. Исследовать экспрессию генов рибозимов и их биологическую активность при инфекции этими рекомбинантными вирусами культуры клеток. Научная новизна и практическая значимость. Мы впервые применили для получения рекомбинантных аденовирусов СЕЮ метод гомологичной рекомбинации в культуре клеток, используемый для создания рекомбинантных Ад человека. Впервые нами была показана трансдукция рекомбинантным аденовирусом птиц культур клеток человека линий Н, НерЗВ и культур клеток животных линий , , , 2, В. При проведении экспериментов i viv впервые показано, что при введении рекомбинантного аденовируса в хвостовую вену мыши экспрессия белка наблюдалась в клетках печени кроме того впервые показана трансдукция клеток опухоли В меланомы у мыши при внутриопухолевом введении рекомбинантного вируса . Впервые получены рекомбинантные аденовирусы птиц СЕЮ, несущие гены функционального и дефектного рибозимов, направленных на расщепление мРНК гена Р вируса гриппа А, под контролем промотора цитомегаловируса человека.