Диссертация на тему "Изменение состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562", скачать бесплатно автореферат по специальности 03.00.03

СОДЕРЖАНИЕ

Г ЛАВА 1 ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели н задачи исследования.м.

. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна

1.5. Теоретическое и практическое значепие работы.

1.6. Финансовая поддержка .

1.7. Публикации

1.8. Апробация работы .

1.9. Объем и структура диссертации

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Убиквитинпротсасомный путь деградации белков
2.1.1. Протеасомы
2.1.2. Ферментативные активности нротеасом.
2.1.3. Убиквитинзависимый протеолиз.
2.1.4. Участие протеасом в важнейших клеточных процессах.
2.1.5. Ингибиторы протеасом
2.2. Молекулярные механизмы регуляции апоптоза
. Вовлечение убиквитинпротеасомного пути в апоптоз
2.3.1. Протеасомные ингибиторы как индукторы апоптоза
2.3.2. Ингибиторы протеасом могут также ингибировать апоптоз.
2.3.3. Ингибиторы протеасом в терапии рака.
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Культивирование клеток
3.2. Анализ фрагментации клеточной ДНК
3.3. Флуоресцентная окраска хроматина
3.4. Выделение препаратов цитоплазматических РНК
3.5. Выделение препаратов ядерных н цитоплазматических протеасом.
3.6. Флуориметрическое измерение проз еолнтической активности протеасом .
3.7. Электрофорез РНК в нативных условиях
3.8. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях
3.9. Обработка протеасом щелочной фосфатазой кишечника теленка С1АР.
3 Обработка РНК с помощью протеасом
3 Транскрипция ш i. в
3 Анализ содержания субъединиц протеасом и их статуса фосфорилирования методом вестернблотинг .
3 Дискэлектрофорез белков по Лэммли.
3 Двумерный электрофорез белков. .
3 Материалы в
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Диэтилмалеат н доксорубицин вызывают апоптоз в клетках К2.
4.2. Воздействие на клетки К2 индукторов апоптоза вызывает изменения в
субъсдиничном составе цитоплазматических протеасом.
. Популяция протеасом в клетке гетерогенна
4.4. После индукции апоптоза в клетках К2 субъединицы протеасом модифицируются.
4.4.1. Цитоплазматические протеасомы.
4.4.2. Ядсрные протеасомы
4.5. При индукции апоптоза в клетках К2 измененяются ферментативные
активности протеасом . .
4.5.1. Воздействие на клетки К2 индукторов апоптоза изменяет специфичность протеолитической активности протеасом
4.5.2. При индукции апоптоза в клетках К2 изменяется специфичность эндорибонуклеазной активности протеасом
4.6. После индукции апоптоза в клетках К2 наблюдается модифицирование
субъединиц протеасом, ответственных за ферментативные активности протеасом а5, 6 и р2 . .
4.7. При индукции апоптоза в клетках К2 изменяется статус фосфорилирования протеасом
4.8. Дефосфорилирование су бъединиц протеасом специфическим образом изменяет ферментативные активности протеасом, выделенных из клеток К2.
4.8.1. Протеолитическая активность протеасом
4.8.2. Механизм регуляции протеолитической активности протеасом при индукции апоптоза связан с фосфорилированием дефосфорилированисм протеасом.
4.8.2. Эндорибонуклеазная активность протеасом
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ. .
5.1. Изменения субъединичного состава протеасом при апоптозе в клетках К
5.2. Изменения ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К2
5.3. Изменение статуса фосфорилирование протеасом при апоптозе в клетках К
5.4. Неспецифическое дефосфорилнрование белковых субъединиц протеасом изменяет специфичность их ферментативных активностей
ВЫВОДЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Впервые при индукции апоптотической программы выявлены изменения статуса фосфорилирования по треонину, серину и тирозину ядерных и цитоплазматических протеасом, а также их эндорибонуклеазной активности. Наблюдается дифференциальная регуляция РНКазной активности протеасом при действии индукторов апоптоза на клетки К2. Полученные результаты свидетельствуют также о существовании пока не исследованной системы регуляции статуса фосфорилирования протеасом причем различной в ядре и цитоплазме в составе программы ответа клетки на действие индукторов апоптоза. Выявлено, что при индукции апоптотической программы в клетках К2 наблюдаются модификации субъединиц Б протеасомы, в том числе каталитических, ассоциированных с протеолитической активностью трипсинподобного типа р2 и РНКазной активностью а5ге1а и абюи. Впервые исследован механизм регуляции протеолитической и эндорибонуклеазной активностей протеасом при индукции апоптоза, а именно обнаружена зависимость исследуемых активностей от дефосфорилирования белковых субъединиц протеасом. Полученные результаты свидетельствуют об изменениях субъединичного состава, ферментативных активностей и статуса фосфорилирования, то есть о перепрограммировании популяции цитоплазматических и ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках К2. Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения молекулярных механизмов, задействованных в апоптозе могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов в лечении лейкемии, гак как индукцию апоптоза используют для терапии рака. Протеасомы человека могут быть использованы в качестве новых фармакологических мишеней i, . Так, ингибиторы протеасом уже сейчас активно исследуются в качестве агентов противоопухолевой терапии Vi . Однако результаты экспериментов с использованием ингибиторов протеасом должны соответствовать данным по сравнительному анализу структуры и функций протеасом в норме и при патологии. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований проекты 1, 6, гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ, СанктПетербургского Научного Центра и годов и с использованием оборудования ЦКП Материаловедение и диагностика в передовых технологиях. По теме диссертации опубликовано печатных работ 6 статей. Петербург, , а также на Международных Конгрессах по молекулярной биологии и генетике Киев, , по внутриклеточному сигналингу Дубровник, , по биологии клетки в культуре Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия СанктПетербург, и ый конгресс Европейского биохимического общества i . Будапешт, . Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 3 страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит рисунков. ГЛАВА 2. Первоначально деградация внутриклеточных белков представлялась довольно простым процессом, осуществляемым лизосомальными ферментами. В настоящее время общеизвестно, что основной регулируемый протеолиз в клетке осуществляется убиквитин и протеасомзависимой системой деградации белка . Протеасома представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, который является основным компонентом убиквитинзависимой системы деградации клеточных белков . Название протеасома, предложенное Арриго и соавторами в i . Последняя сама по себе не способна деградировать клеточные белки, однако может расщеплять некоторые короткие пептиды и развернутые белки . Протеасомы присутствуют в клетках всех организмов от архебактерий до высших эукариотических организмов, что свидетельствует об их абсолютной важности для нормальной жизнедеятельности клетки. АТФзависимый протеолитический комплекс, обладающим молекулярной массой около 2. МДа, названный протеасомой, осуществляет специфическую деградацию белков, конъюгированных с убиквитином , . Исследования строения этого комплекса методами электронной микроскопии и компьютерной томографии показали, что протеасома имеет симметричную гантелеобразную структуру i .

Название работы	Автор	Дата защиты
Изучение вторичной и третичной структуры рибосомных белков из малой 30S субчастицы Escherichia coli	Гогия, Зураб Валерьянович	1984
Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака	Постригань, Богдан Нилович	2009
Получение рекомбинантных нуклеокапсидных белков вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) и их применение в качестве специфических компонентов диагностической тест-системы для определения антител к вирусу РРСС	Алексеев, Константин Петрович	2004

Электронная библиотека диссертаций

Изменение состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562