Новые сайт специфические эндонуклеазы и ДНК-метилтрансферазы и аспекты их применения в молекулярной биологии

• Автор: Железная, Людмила Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино-на-Оке
• Количество страниц: 157 с. : ил

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИМОДИФИКАЦИИ

1.1. Назначение и номенклатура систем рестрикциимодификации.

1.2. РМ системы типа 1.

1.2.1. Организация систем.

1.2. 2. Трапслокацпя ДНК

1.3. МРсистемы типа II.

1.3.1. Классификация эндонуклеаз РМ систем типа II.

1.3.2. Структура эндонуклеаз типа II

1.3.3. Взаимодействие эндонуклеаз с ДНК.

1.3.4. Нсмутабельность эндонуклеаз типа II
1.4. РМ системы типа III.
1.5. РМ системы типа IV
1.6. Сайтспецифичсскис ДНКмети.ттрансферазы.
1.7. Непарные метилазы и эндонуклеазы рестрикции
I.8. Биологическая роль и метилтровакия.
1.9. Системы ограничения метилированной ДНК у Е.соЧ.
II. С АЙТСПЕЦИФИЧЕСКИЕ НИКАЗЫ.
III. РЕГУЛЯТОРНЫЙ СБЕЛОК РМ СИСТЕМ
III. 1. Общие свойства Сбелков различных систем
Ш.З. Сбелок системы V
IV. ПРИМЕНЕНИЕ САЙТСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ И ДНК МБТИЛТРАНСФЕРАЗ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
I. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.
1.1. Материалы
1.2. Оборудование.
II. МЕТОДЫ
.1. Скрининг штаммов на наличие РМ систем
.2. Получение лизата клеток.
.3. Определение оптимальных условий проявления эндонуклсазной активности.
.4. Определение эндонунлеазной активности.
.5. Определение функциональной чистоты эндонуклеазы.
.6. Определение сайта, узнаваемого эндонуклеазой
П.7. Определение точек расщепления на ДНК эндонуклеазами
.8. Реакция ссквеннрованкя
П.9. Мсчснис олигонуклеотидов.
Выделение метидгрансфсраз.
Определение мстилазной активности.
Определение метилируемого основания.
Радиоавто1рафия фрагментов ДНК. меченных .
Полимеразная цепная реакция.
Очистка фрагментов ДНК
Реакция лигирования.
Получение компетентных клеток.
II. 1. Трансформация компетентных клеток
. Индукция экспрессии генов
Электрофорез белков.
Торможение в i
Определение последовательности, узнаваемой Сбелксм футпринтинг
Транскрипция i vi.
Получение гибридов РНК с ДНК
Трансляция i vi.
Выделение ДНК.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ
1.1. Сайтспсцифичсские эндонуклеазы рестрикции
1.1.1. Сайтспегрфическая эндонуклеаза .
П.1.1.1. Выделение эндонуклеазы.
1.1.1.2. Определение функциональной чистоты эндонуклеазы.
I. 1.1.3 . Определение сайта узнавания и точек расщепления ДНК
III.1.1 .4. Некоторые свойсгва эндонуклеазы .
III. 1.2. И и 3I и эндопуклеазы с новыми специфичностями
1.1.3. Эндонуклеаза ПИ бифункциональный фермент.
1.1.4. Эндонуклеаза III.
1.1.5. Эндонухлсаза 6I неошизомер 3.
1.1.6. Эндонуклеаза I неошизомер II.
III. 1.6.1. Определение характера расщепления ДНК эндонуклеазой 5I в
завнсисмости от нуклеотидного окружения сайта
III. 1.7. Эндонуклеазы I к 5I.
III. 1.8. Сводная характеристика эндонуклеаз.
Ш.2. Сайтспсцифичсские ДНКметилтрансферазы.
1.2. 1. МстилазаМ. I4I.
Ш.2.2. М. 5 метилирует только одну цень.
1.2.3. Мстилазы .6I и .I.
1.2.4. Клонирование и экспрессия мстилазы .
1.2.4.1. Получение библиотеки генов ДНК
1.2.4.2. Получение супсрпродуцснта мстилазы I.
1.2.4.3. Синтез мстилазы в системе трансляции i vi
III. 3. Сайтспецифичсская никаза 6I
Ш.3.1. Идентификация эндонуклеазы 6I как сайтспецифичсской инказы
1.3.2. Свойства никазы
1.3.3. Никаза 6I способна к многократному повторению актов расщепления.
1.4. Регуляторный сбслок РМ системы V
III 4.1. Клонирование и получение очищенных Сбелков.
Ш.4.2.0пределсние фрагмента ДИК. связывающего Сбелки
1.4.3. Определение последовательности, узнаваемой Сбелками
1.5. Применение эндонуклеаз рестрикции.
1.5.1. Векторы для получения тандемных повторов фрагментов ДНК мультипликационные векторы
1.5.2. Решение проблемы второго кодона и получение транскриптов со строго определенным 3концом с использованием эндонуклеаз типа II
1.5.3. Селективная амплификация фрагментов геномной ДНК метод.
1.5.3.1. Принцип метода
1.5.3.2. Дополнительные аспекты метода
1.5.4. Метод гибридизашюнного анализа нуклеиновых кислот с использовансм сайтсиецифических нихаз
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
РМ рестрикциямодификация
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
тРНК транспортная РНК
АТФ аденозннтрифосфат
ГТФ гуанозннтрнфосфат
ЯадснозилЬметионин
ДМСО диметалсульфоксид
I изопропилрОтиогалактолнранознд
X 5бром4хлор3индолил0 галзктозид
1ЩР полимеразная цепная реакция
додеиилсульфат натрия
ДТТ дитиотрейтол
ЭДТА этилснднаминтетрауксусная кислота i трисгидроксимстиламиномстан
Ы2гидроксиэтил пипсразинМ2этанссрная кислота I 1.4пнперазинэтансерная кислота
Введение


В настоящее время этот тип представлен болсс чем системами из разных микроорганизмов Миггау, . На основе гнбридизационного скринирования бактериальных ДНК и серологического скринироваиия бактериальных экстрактов системы делятся на семейства 1Л. В, 1С и ГО, однако их организация и принцип функционирования очень сходны, поэтому приводимое ниже описание справедливо для всех семейств. Организация систем. Системы типа I наиболее сложно устроенные из всех известных систем. Они представляют собой большой и сложный мулыимерный белок кДа, который обладает мстилазной и экдоиуклеазной активностями. Белок образован тремя типом субъединиц, кодируемыми тесно сцепленными генами и , и . Субъединица около кДа определяет специфичность узнаваемой на ДНК последовательности , v . При объединении субъединицы с субединицами около кДа в отношении образуется модифицирующий фермент i , , . Включение субъединиц около 0 кДа с образованием комплекса iivi приводит к появлению эидонуклеазной активности. Ген транскрибируется со своего собственного промотора, тогда как гены и транскрибируются вместе с отдельного промотора i , . Узнаваемый сайт состоит из двух несимметричных последовательностей, разделенных строго определенным количеством пар нуклеотидов, не значащих для узнавания. Например, в случае сВ, узнающей сайт 8, число незначащих нуклеотидов должно быть строго равно 8, а в случае ЕсоК 6 6. Субъединица содержит два домена, участвующих в узнавании сайта ii i каждый из доменов ответственен за узнавание одной из значащих частей разоравнного сайта , , , . Домены, состоящие примерно из 0 аминокислотных остатков каждый, соединены между собой линкером длиной от до 0 аминокислотных остатков, который обеспечивает контакт с другими субъединицами и контролирует длину несущественной для узнавания части сайта. Сучастки имеют большую гомологию с линкером i , ii . В целом суъединица имеет вращательную ось симметрии второго порядка . Рис. Нуклеотидные последовательности генов из разных семейств обнаруживают протяженные вариабельные области, фланкирующие небольшие консервативные участки , , , . Рис. Модель структуры ферментативного комплекса РМ системы типа I и его ориентации относительно ДИК. Черным цветом обозначена субъединица . Взято из работы vi , . Метилазы типа I могут узнавать три статуса сайта нсметнлированный тогда запускается процесс расщепления ДНК, полуметнлировашшй тогда происходит метилирование и метилированный по обеим цепям тогда фермент отсоединяется от ДИК. Метнлазы семейств I и 1 обнаруживают сильно выраженное предпочтение к взаимодействию с полумегилированной последовательностью , , тогда как метилазы семейста 1В таким свойством не обладают . Продуктом метилирования всех известных метилаз РМ систем тина I является 6здешш. Мстилазные субеднницы контактируют между собой, и каждая из мегилазных субьединии метилирует одну из значащих для узнавания частей сайта . Метилазы внутри одного семейства обнаруживают высокую степень гомологии до . О структуре субъединицы информации немного. Известно, что эти суьсдигащы всех семейств содержат мотив. ДНК. В присутствии донора мстильной группы. АГФ эндонуклеазиая актнвоегь расщепляет обе цепи ДНК на расстоянии до. Эффективность расщепления как i vi, так и i vi сильно зависит от количества сайтов в положении i i, и расщепление происходит примерно посередине между соседними сайтами , . Долгое время было непонятно, как происходит расщепление ДНК на таком большом расстоянии от сайта. Только с использованием электронной микроскопии было показано, что акту расщепления ДНК предшествует ее транслокация i , . В настоящее время существует две модели механизма расщепления ДНК эндонуклеазами типа I. Согласно первой модели i ,, после связывания ферментативных комплексов с сайтами каждый из комплексов подтягивает к себе, закручивая. ДНК, и, когда два комплекса столкнутся примерно посередине между сайтами, происходит расщепление ДНК. Для системы соК1 вычисленная скорость транслокации составляет около 0 п. Такой механизм расщепления ДИК приводит к тому, что не образуются гомогенные фрагменты.