Клонирование гена бета-галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus и характеристика продукта этого гена

• Автор: Фокина, Наталия Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1996
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

рГалактозидаза и ее природные источники. Промышленное использование ргалактозидазы. Организация генов ргалактозидаз.
Клонирование генов ргалактозидаз бактерий и структура соответствующих ферментов Структура ргалактозидаз Регуляция ргалактозидазного синтеза Физикохимические свойства ргалактозидаз. Субстратная специфичность ргалактозидазы Иммобилизация ргалактозидаз ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы и плазмиды.
Химические реагенты и ферменты нуклеотидного обмена Бактериальные среды и условия культивирования Выделение и анализ плазмидной ДНК Выделение хромосомной ДНК Т. еШапоИсиБ Конструирование геномной библиотеки.
Отбор активных клонов на чашках Очистка ргалактозидазы Приготовление клеточных экстрактов Фракционирование сульфатом аммония Гельфильтрация

ф 2.8.4. Анионобменная хроматография

2.9. Электрофорез и изоэлектрофокусирование

2 Методы определения активности ргалактозидазы

. Определение активности на хромогенных субстратах

. определение активности на лактозе
I 2 Определение концентрации белка
2 Определение термостабильности и рНстабильности
2 Иммобилизация галактозидазы
2 Определение активности иммобилизованной
ргалактозидазы
2 Определение термостабильности и рНстабильности
иммобилизованного белка
ч 2 Определение нуклеотидной последовательности
гена ргалактозидазы и компьютерный анализ полученных данных.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание банка генов и отбор активных клонов
3.2 Определение нуклеотидной последовательности
гена ргалактозидазы Т. еапоНсиэ.
3.3 Выделение и очистка рекомбинантной ргалактозидазы
3.4 Субстратная специфичность и физикохимические
характеристики ргалактозидазы
3.5 Иммобилизация ргалактозидазы Т. еапо И сие
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
0 Сокращения используемые в тексте диссертации
Да дальтон
Ед. единица активности фермента
ПААГ полиакриламидный гель
ДТТ дитиотрейтол
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
БОБ додецилсульфат натрия
РС буфер фосфатцитратный буфер
Среда ЬВ среда ЬигХаВегЧгап
Субстраты
р пнитрофенил
рИРСа пнитрофенилбетаДгалактопиранозид
оШэ.1 онитрофенилбетаДгалактопиранозид
рИРХу пнитрофенилбетадксилозид
рЦ пнитрофенилбетаДглюкозид
рИраСа пнитрофенилальфаДгалактопиранозид
МДОа 4метилумбеллиферрилбетаДгалактозид
ВВЕДЕНИЕ


Галактозидаза и ее природные источники. Промышленное использование ргалактозидазы. Организация генов ргалактозидаз. Клонирование генов ргалактозидаз бактерий и структура соответствующих ферментов Структура ргалактозидаз Регуляция ргалактозидазного синтеза Физикохимические свойства ргалактозидаз. Субстратная специфичность ргалактозидазы Иммобилизация ргалактозидаз ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы и плазмиды. Химические реагенты и ферменты нуклеотидного обмена Бактериальные среды и условия культивирования Выделение и анализ плазмидной ДНК Выделение хромосомной ДНК Т. ШапоИсиБ Конструирование геномной библиотеки. Отбор активных клонов на чашках Очистка ргалактозидазы Приготовление клеточных экстрактов Фракционирование сульфатом аммония Гельфильтрация
ф 2. Т. еапоНсиэ. Иммобилизация ргалактозидазы Т. Ед. Шэ. Актуальность темы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к ферменту лактазе 0галактозидаза КФ 3. Галактозидаза расщепляет молочный сахар лактозу на моносахариды глюкозу и галактозу. Фермент может быть использован в промышленности для гидролиза лактозы в молоке и молочной сыворотке. Ферментативный гидролиз лактозы в сыворотке позволит создать на его основе безотходную технологию переработки молока и решить проблему охраны окружающей среды, возникающую в связи с загрязнениями, вызываемыми сливом отходов молочной проимышленности. Использование фермента в промышленности позволяет решить важную экономическую задачу получения сахаристых веществ из нетрадиционного сырья. Молочные продукты, где лактоза заменена сбраживаемой смесью моносахаридов глюкозой и галактозой, находят широкое применение в сельском хозяйстве, медицине, микробиологической промышленности, различных отраслях пищевой промышленности. Особый интерес представляют ргалактозидазы термофильных бактерий. Они способны продолжительно действовать при при высоких температурах выше С и обладают рядом преимуществ по сравнению с ргалактозидазами грибов температурный оптимум С используемых в настоящее время в биотехнологическом производстве. В частности, для них характерны более высокие удельные активности. В связи с высокими температурными оптимумами, гидролиз лактозы возможно проводить при высоких
ф температурах. Это препятствует бактериальному заражению при длительном использовании фермента в иммобилизованном состоянии. Одним из способов получения и изучения темостабильных ферментов, продуцируемых термофильными анаеробными бактериями, является клонирование и экспрессия соответствующих генов в мезофильных микроорганизмах. Цель и задачи исследования. Целью работы является клонирование гена галактозидазы i Е ii в . Т.i из клеток . Галактозидаза и ее природные источники. Галактозидаза галактозидгалактогидролаза, 3. Огликозильные соединения. Она расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу. Кроме реакции гидролиза некоторые галактозидазы способны переносить остатки галактозы на различные акцепторы . БгалактопиранозилЧглюкопираноза основной компонент молока и молочной сыворотки. Это плохорастворимый, несладкий, практически несбраживаемый дисахарид, легко кристализующийся даже в невысоких концентрациях. Фермент гидролизует лактозу до изомолекулярной смеси глюкозы и галактозы. На практике, в зависимости от условий изомолекулярная смесь образуется не всегда. Галактозидаза широко распространена в природе, содержится в растительных и животных организмах. Фермент встречается у многих бактерий, особенно обитающих в средах, содержащих специфические субстраты. Прежде всего это относится к микрофлоре, хорошо растущей на молочных продуктах, где потребляется естественный субстрат лактоза.