Структурно-функциональный анализ фактора терминации трансляции эукариот eRF1

• Автор: Сеит Неби Алим Сабри
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил

1.1. Первичные и третичные структуры факторов

терминации 1го класса

1.2. Роль рРНК при терминации трансляции

1.3. Зависимость терминации трансляции от контекста

мРНК и от пептидилтРНК

1. 4. Гипотезы о декодировании стопкодонов

1.5. Взаимодействие 1 и 3

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы

2.1.1 Штаммы бактерий и плазмиды

2.1.2 Среды
2.1.3. Реактивы
2.1.4. Ферменты
2.1.5. Олиг онуклеотиды
2.2 Методы исследований
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из .i
2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и
реакция лигирования ДНК
2.2.4. Трансформация . i плазмидной ДНК
2.2.5. Трансформация . i плазмидной ДНК методом электропорации
2.2.6. Очистка фрагментов ДНК в легкоплавкой агарозе
2.2.7. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.2.8. Сайтнаправленный мутагенез с помощью набора i
2.2.9. Сайтнаправленный мутагенез с помощью праймеров, содержащих уникальный сайт рестрикции
2.2 Сайтнаправленный мутагенез методом мегапраймера
2.2 Сайтнаправленный мутагенез согласно протоколу i
2.2 Синтез и выделение белков
2.2. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ
2.2 Определение активности
2.2. Определение ГТФазной активности
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Клонирование и экспрессия
3. 2. Сайтнаправленный мутагенез и определение функциональной активности
3.3. Минидомен
3. 4. Минидомен I
3.5. Минидомен
3.6. Заключение ВЫВОДЫ БЛАГОДАРНОСТИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ аденозинтрифосфат
ЬСА бычий сывороточный альбумин
ГДФ гуанозиндифосфат
ГТФ гуанозиприфосфат
ГТФаза ГТФ гидролаза
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ дитиотрейтол
ед. акт. единица активности
импмин импульсов в минуту
кДНК ДНК комплиментарная РНК
мкг микрограмм
мкл микролитр
мкМ микромолярная концентрация
мМ милимолярная концентрация
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
ПЦР полимеразная цепная реакция
РИК рибонуклеиновая кислота
РНКаза рибонуклеаза
рРНК рибосомальная рибонуклеиновая кислота
ТЕМЕД ,, ,Ы1 тстраэтилендиамид
тРНК транспортная рибонуклеиновая кислота
ЭДТА этилеидиаминтетрауксусная кислота
6оо оптическая плотность при 0 им
УФ ультрафиолет
ЕТТ дитиотрейтол
ЕША этилендиаминтетраацетат
РТС изопропилгиорЭгалактозид
РААО полиакриламидный гель
РМ8Р фенилметансульфонилфторид
ЯР фактор терминации трансляции
8 доде илсул ьфат натрия
ВВЕДЕНИЕ


Ключевую роль в этом процессе играют белковые факторы терминации трансляции, которые подразделяются на два класса факторы первого класса, или кодонспецифичные факторы, принимающие участие в узнавании стопкодона и в гидролизе пептидилтРНК и факторы второго класса, обладающие способностью связывать и гидролизовать ГТФ, и стимулирующие активность факторов первого класса. Хотя общая схема терминации трансляции давно известна, молекулярные механизмы этого процесса остаются неясными. В частности, неизвестно, как происходит декодирование стопкодоиа в рибосоме эукариот и каким образом катализируется гидролиз пептидилтРНК в пептидилтрансферазном центре рибосомы. Недавно для факторов терминации трансляции первого класса прокариот ЯГ1 и Я2 найдены трипептиды участвующие в узнавании второго и третьего нуклеотидов стопкодонов. Изза существенного структурного и функционального различия факторов терминации прокариот и эукариот эти данные не могут быть перенесены на эукариотическую систему терминации трансляции. До сих пор, проблема декодирования стопкодонов у эукариот остается нерешенной, хотя в последние года эта область привлекает все возрастающие внимание исследователей. Основная цель данной работы состояла в выяснении функциональной роли аминокислотных остатков, находящихся в высококонсервативных минидоменах 1 человека. В задачи работы входило получение генноинженерных конструкций, позволяющих проводить сверхэкспрессию 1 человека в клетках . I и выделение, очистка и функциональная характеристика мутантных форм . К началу исследования, в базах данных имелось достаточно данных по первичной структуре факторов терминации из разных организмов, что позволило классифицировать все аминокислотные остатки на инвариантные, консервативные, полуконсервативные и вариабельные. Кроме того, в ходе исследования стала известна трехмерная структура человека, установленная в лаборатории Д. Барфорда, что помогло существенно уточнить интерпретацию полученных результатов. Полученные нами результаты позволили опровергнуть ряд гипотез, появляющихся в литературе в гг. РНК. Мы выявили ряд функционально существенных остатков аминокислот в консервативных участках , что подтвердило ранее высказанную гипотезу о том, что узнавание сгопкодонов у экариот и прокариот осуществляется но разному. Глава 1. Основополагающие работы, касающиеся терминации белкового синтеза, были опубликованы в конце шестидесятых годов прошлого века. Тогда были установлены два факта, подтвердившиеся всеми дальнейшими исследованиями. Вопервых, терминация происходит на рибосомах в тот момент, когда в участке рибосомы находится один из трех терминирующих кодонов , или , а в Ручастке располагается иептидилтРНК. Вовторых, терминация зависит от присутствия в рибосомах особых белков, получивших название факторы терминации i i у прокариот и у эукариот. У прокариот были найдены два фактора 1 и 2, у эукариот только один . При этом бактериальные факторы могли читать но два кодона из трех 1 и , 2 и . Терминацию трансляции наблюдали как i viv, гак и i vi, в бесклеточных и реконструированных системах , , . В последующие лет существенных изменений в представления о терминации трансляции внесено не было. К середине х годов были установлены нуклеотидные последовательности генов, и соответственно, первичные структуры белков, и 2 . Хотя факторы терминации были открыты практически одновременно у бактерий и животных, первичная структура была установлена не сразу. Сначала было сообщено, что аминокислотная последовательность гомологична бактериальным гриптофанилтРНКсинтетазам . Когда были установлены первичные структуры триптофанилтРНКсинтетаз быка . Поэтому было высказано предположение v . Вскоре прямые опыты подтвердили справедливость этих подозрений v . Оказалось, что расшифрованная ДНК действительно описывает структуру тригпофанилтРНКсинтстазы кролика, а не . Когда в результате очистки из регикулоцитов кролика был получен гомогенный белок, удаюсь провести микросеквенированис ряда пептидов этого белка. Анализ этих пептидов в банке данных первичных структур белков показа v . Единственным исключением был дрожжевой белок ИнгеВечтомов и Андрианова, ii i, который считали вовлеченным какимто образом в процесс трансляции ТерАванссян и ИнгеВечтомов, .