Взаимодействие транспортной РНК с рибосомами Escherichia coli

• Автор: Кириллов, Станислав Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 328 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИЗУЧЕНИЯ МАТРИЧНОЗАВИСИМОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ тРНК С

СУБЧАСТИЦАМИ РИБОСОМ II I .

1.1. Кодонантикодоновое взаимодействие тРНК в малой

рибосомной субчастице

1.2. Нерешенные вопросы матричнозависимого взаимодействия тРНК с субчастицей.

1.3. Выбор условий для количественных измерений взаимодействия матрицы и тРНК с рибосомами.

1.4. Термодинамика взаимодействия синтетических матриц с субчастицей и рибосомами

1.4.1. Взаимодействие поли и с рибосомами

1.4.2. Взаимодействие олигорибонуклеотвдов с рибосомами

1.4.3. Сравнение взаимодействия природных и синтетических матриц
1.5. Причины инактивации и природа гетерогенности
субчасткц i vi
1.6. Заключение к первой главе.
1.7. Выводы к первой главе.
Глава П. ДОКАЗАТЕЛЬСТВО СУЩЕСТВОВАНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ДВУХ ФИЗИЧЕСКИ И ФУНКЦИОНАЛЬНО РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ САЙТОВ ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ тРНК НА
СУБЧАСТКЦЕ.
2.1. Нерешенные вопросы о функциональной роли и свойствах сайтов субчастицы.
2.2. .Дискриминация сайтов с помощью антибиотиков и
установление вдентичности функциональных свойств сайтов субчастицы с А и Р сайтами рибосомы.
2.3. Кинетические и термодинамические параметры связывания тРНК с активными сайтами субчастиц
2.4. Заключение к второй главе.
2.5. Выводы к второй главе.
Глава Ш. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ тРНК В РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ФОРМАХ С РИБОСОМАМИ.
3.1. Состояние проблемы и основные нерешенные вопросы
3.2. Методические особенности изучения адсорбции тРНК
на рибосомах.
3.3. Гетерогенность комплексов V рибосома
поли
3.4. Дискриминация связывания тРНК и
тРНК с Р и А сайтами рибосомы
3.5. Термодинамические параметры адсорбции тРНК
и тРНК на Р сайт рибосомы.
3.6. Сравнение Р сайтов субчастицы и рибосомы. ИЗ
3.7. Наличие кодонантикодонового взаимодействия на
Р сайте.
3.8. Взаимодействие деацилированной тРНК с рибосомой и природа Е сайта.
3.9. Кодонантикодоновое взаимодействие тРНК
и тРНК на А сайте комплекса рибосома поли и
3 Опровержение принципа исключения при связывании тРНК с рибосомами
3 Заключение к третьей главе.
3 Выводы к третьей главе.
Глава 1У. КОНФОШАЩОННЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ тРНК И ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
4.1. Конформационные изменения тРНК и задачи данного
исследования.
4.2. Термодинамика взаимопревращений конформеров
i с различным сродством к рибосомам .i
4.3. Конформационное состояние тРНК в растворе
в зависимости от ее функциональной формы
4.4. Заключение к четвртой главе
4.5. Выводы к четвертой главе
Глава У. РОЛЬ ФАКТОРОВ И ЭНЕРГЕТИКА ЭЛОНГАЦИИ
5.1. Стабильность комплексов аатРНК с А сайтом, образованных с участием ер т
5.2. Энергетика цикла элонгации
5.3. диффузионный механизм транслокации и гипотеза
Лед ера
5.4. Энергетическое распределение сайтов между суб
частицами и соответствие модели рибосомы Уотсона.
5.5. Заключение к пятой главе
5.6. Выводы к пятой главе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
6.1. Материалы
6.2. Приборы и оборудование.
6.3. Выделение рибосом и рибосомных субчастиц
6.3.1.Выделениенеочищенных уоэ рибосом
6.3.2.Выделение Б рибосом прочных пар
6.3.3.Выделение изолированных и Б субчастиц
6.4. Получение препаратов транспортной РНК
6.5. Получение смеси неочищенных амиоацилтРНК
синтетаз и аминацилирование тРНК.
6.6. ЕЫделение факторов элонгации ЕРтитБ
6.7. Синтезнполии и фракционирование препаратов поли и
6.8. Выделение рибосомных белков.
6.9. Измерение кошлексообразования.
6.9.1. Кодонзависимое связывание деацилированной тРНК РЬетРНК и АсРЬе тРНК С ЗОБ субчастицами и Б рибосомами
6.9.2. Связывание полии с рибосомами.
6.9.3. Обработка результатов комплексообразования.
6 Метод спиновых меток
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ЛИТЕРАТУРА


Обедненные поБ1 белку ЗОБ субчастицы давали пониженное содержание стабильной компоненты на рис. З . Таким образом, присутствие Б1 белка в ЗОБ субчастицах увеличивает на 2 порядка величину константы ассоциации полии с этими субчастицами. Кр характерную для рибосомных субчастиц, не содержащих Б1 . В противном случае определение независимой константы взаимодействия тРНК с комплексом рибосома мРНк будет затруднено изза зависимости связывания от концентрации полии уравнение 5, 1. С увеличением молекулярной массы поли и до килодальтон константа ассоциации ее с ЗОБ субчастицами, не содержащими Б1 белок, возрастает на порядок величины , . Более подробные сведения о зависимости связывания поли и от ее молекулярного веса в этом диапазоне молекулярных весов отсутствуют. Работа Линца и др. Б1 белка противоречит этим данным. В этой работе Б1 белок не влиял не только на связывание коротких олигонуклеотидов с рибосомами, но и на поли и с длиной цепи нуклеотидов. Рис. З, Стимуляция связываниярНПОЛИ и с ЗОБ субчастицами белком . Б количество поли и в комплексе зоз субчастица поли и , рассчитанное по кривым I и 2 на рис. А.
по величине к найденной нами как раз для зоб субчастиц, содержащих Б1 белок . Так как изотермы адсорбции в работе Линда и др. Кроме белка Б1 , ряд других рибосомных белков принимает пряглое или косвенное участие в формировании мРНКсвязывающего центра это белки Б4 , БП , Б , Б Б , Б . С увеличением размера полии увеличивается и набор Б белков, с которыми она взаимодействует . Так как в зависимости от способа получения рибосом часть белков, являющихся фракционными, может быть отмыта в разной степени, то константа связывания полии, а также, повидимому, и других матриц может значительно различаться у препаратов рибосом в зависимости от способа их выделения. Это относится и к стабильной компоненте комплекса зоб субчастиц поли и, содержащего Б1 белок. Так, разные препараты субчастиц, полученные нами, имели константу связывания полии с зоб субчастицами от 2,7 до 7 М . Несмотря на колебания абсолютной величины константы связывания полии с рибосомами между разными препаратами, представляло интерес найти общие закономерности взаимодействия матрицы с рибосомами зависимость от концентрации ионов магния, ионной силы, и температуры и оценить вклад субчастиц в это взаимодействие. Такая работа была проделана с препаратом зоб субчастиц, наиболее близком к нативному, т. Б1 белок и имеющим максимальную константу связывания полии . На рис. Результаты измерений представлены в та. ЮМи. МН ЮЛШ. Рис. Влияние внешних условий на константу ассоциации лолии с зоз субчастицами содержащими Б1 белок. Инкубационные смеси содержали в 0,2 мл пмоль ЗОБ субчастиц, пмоль Г3н поли и. Связывание проводили в буфере 0, М трис НС1 , 7,1, содержащем 0, М 1С, 0,1 М ЭДТА и изменяющиеся концентрации шСИ . Ш, 3 М. Ш, 3 0 й. М.
Таблица I. Стабильность двухкомпонентных комплексов зоб субчастица поли и и об рибосома поли и в 0, М триснс буфере, 7,1, содержащем 0,1 М ЭДТА и указанные концентрации мС и хлористого аммония. Проведено сравнение параметров взаимодействия поли и с Э рибосомой, полученной при добавлении Б субчастиц . Оказалось, что параметры взаимодействия поли и с 3 рибосомой практически совпадают с таковыми для зоб субчастицы, т. Б субчастица не только не взаимодействует с матрицей в изолированном виде , но и в составе полной Б рибосомы не принимает никакого участия в образовании
полии связывающего центра табл. В табл. Таблица 2. Термодинамические параметры взаимодействия поли и с субчастицами и рибосомами. Рибосомы Д Н кжмоль ккалмоль о Шмоль. К кал моль. Основу этого взаимодействия составляет, вероятно, взаимодействие сахарофосфатного остова поли ц с рибосомными белками и 3 РНК. Константа ассоциации поли и с рибосомой не зависит от в диапазоне от 6,6 до 8,1, так что, возможно, аминогруппы лизина и аргинина рибосомных белков участвуют во взаимодействии с поли и, что подтверждается химической модификацией рибосомных белков специфическими на эти аминокислоты реагентами , .