Получение трансгенных растений сахарной свеклы и их молекулярно-биологический анализ

• Автор: Захарченко, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 134 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИ Й

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика агробактериальных векторных систем

1.1.1. Структурнофункциональная организация Л и Илплазмид

1.1.2. Гены вирулентности Т и Шплазмид

1.1.3. Типы векторных систем

1.2. Методы трансформации растений

1.2.1. Методы агробактериальной трансформации растений

1 2.2. Методы прямого переноса ДИК в растение

1.3. Преимущества и недостатки различных методов
генетической трансформации растений
1.4. Селекция трансформированных тканей растений
1.5. Экспрессия чужеродных генов и се регуляция в трансгенных растениях
1.6. Успехи и перспективы генной инженерии растений
1.6.1. Метаболическая инженерия растений
1.6.2. Растения как продуценты целевых белков
1.6.3. Устойчивость к фитопатогеиам
1.6.4. Устойчивость к насекомым вредителям и другим беспозвоночным
1.6.5. Устойчивость к гербицидам
1.7. Основные направления исследований в области
клеточной биотехнологии сахарной свеклы
1.7.1. Клональное размножение
1.7.2. Сомаклонапьная изменчивость
1.7.3. Клеточная селекция
1.7.4. Соматическая гибридизация
1.7.5. Использование культуры пыльников и семяпочек
1.8. Генетическая инженерия сахарной свеклы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы и оборудование
2.1.1. Растительный материал
2.1.2. Оборудование
2.1.3. Реактивы, среды и ферменты
2.1.4. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Методы
2.2.1. Электрофорез ДИК в агарозе
2.2.2. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле
2.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля
2.2.4. Элюция ДНК из полиакриламидного геля
2.2.5. Лигирование
2.2.6. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр по Саузерну
2.2.7. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр из колоний на чашках
2.2.8. Получение радиоактивных меченых препаратов Д1ГК
2.2.9. Гибридизация по Саузерну
2.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2 Получение компетентных клеток .i и их трансформация
2.2 Индуцирование процессинга агробактериальной ТДНК экссудатами сахарной свеклы
2.2 Колонизация семян и растений сахарной свеклы мстилотрофными бактериями v
2.2 Агробактериальная трансформация сахарной свеклы
2.2 Перенос плазмидной ДНК при помощи коныогации в клетки агробактерий
2.2 Перенос плазмидной ДНК при помощи конъюгации в клетки метил обактсрий
2.2 Определение активности ферментов неомицинфосфотрансферазы II ЫРТII
2.2 Определение нопалинсинтазной активности и атропина в транформированных растительных тканях
2.2 Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции ПЦР
2.2 Биотесты с белковыми экстрактами из трансгенных растений
2.2 Статистическая обработка результатов исследований
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка методов генетической трансформации сахарной свеклы vi .
3.1.1. Изучение процессинга ТДНК агробактерий под действием экссудатов сахарной свеклы
3.1.2. Влияние содержания фитогормонов на эффективность регенерации побегов и образование корней
3.2. Генетическая трансформация сахарной свеклы
3.2.1. Неопластическая трансформация сахарной свеклы дикими штаммами агробактерий
3.2.2. Генетическая грансформация сахарной свеклы агробактериальной векторной системой, содержащей ген
3.3 Влияние метило бактерий v на эффективность регенерации эксплантов и скорость прорастания семян сахарной свеклы
3.3.1. Получение трансгенных растений, содержащих ген
3.4. Создание конструкций с геном антимикробного пептида цекропина Р1, пригодных для трансформации широкого круга растений
3.4.1. Перенос конструкций с геном антимикробного пептида
цекропина Р1 из клеток агробактерий рОУЗ 1 и А1 в растения сахарной свеклы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целыо данной работы явилась разработка метода генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы. Разработать методику регенерации растений сахарной свеклы из различных эксплантов и оценить регенерационный потенциал некоторых отечественных сортов. Исследовать присугствие в экссудатах сахарной свеклы специфических сигнальных молекул, индуцирующих контролируемый viгенами процессинг ТДНК. Определить сорта и эксплангы сахарной свеклы с высокой viиндуцирующей активностью. Разработать методику генетической трансформации сахарной свеклы с помощью агробактериальных векторных систем. Исследовать эффект ассоциативных метилобактерий iv на регенерацию и агробактериальную трансформацию сахарной свеклы. Получить трансгенные растения сахарной свеклы, экспрессирующие наряду с селективными маркерными генами также гены, определяющие ценные хозяйственные свойства растений. Провести молекулярногенетический анализ трансгенных растений. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ы. Болезни неопластической трансформации растений, вызываемые почвенными бактериями i i и i i, связаны с переносом в клетки растений и интеграцией в их геном специфической экспрессируемой в растениях части агробактериальных i и i плазмид, ТДНК, несущей гены. В результате этого процесса в растительных тканях начинается опухолевый рост, который однажды начавшись, может продолжаться и в отсутствие бактерий, а опухолевая ткань способна расти на питательной среде, не содержащей экзогенных ауксинов и цитокининов. Опухолевые ткани синтезируют новые для растений производные аминокислот и сахаров, известные как оиины. Тип опина, синтезируемого в опухоли например, нопалин, октопин, агроцинопин, маннопин, агропин и др. Клетки агробактерий используют опины в качестве источников углерода и азота. В связи с этим агробактерии с i и iплазмидам и называют генетическими колонизаторами, а их ТДНК можно рассматривать как природный вектор для переноса генетической информации из бактериальной клетки в растение. ТДНК также в клетки дрожжей , и человека ii . На основе ТДНК сконструированы различные агробактериальные векторы для генетической инженерии растений. В настоящее время разработаны различные типы агробактериальных векторных систем. Большинство штаммов рода i содержат i или iплазмиды более 0 т. Вырезание ТДНК в бактериальных клетках и ее транспорт в клетки растений осуществляется в результате экспрессии vгенов, расположенных на i и i плазмидах, и vгенов, расположенных на бактериальной хромосоме. Вирулентные гены агробактерий на i и i плазмидах собраны в особую область vi размером т. В i плазмидах в области vi локализовано различных оперонов, организованных в один регулон. Район ТДНК имеет размер около т. Для процессов вырезания и переноса ТДНК необходимо фланкирование ТДНК несовершенными прямыми повторами размером п. Правая граница может одна определять полярность переноса ТДНК. За исключением генов vi и vi, опероны viобласти не транскрибируются в отсутствии определенных растительных индукторов. Координированная активация viсистемы происходит, когда бактерии оказываются около пораженных органов растений, выделяющих вещества индукторы viгенов. По своей химической природе сигнальные молекулы растений являются низкомолекулярными моноциклическими фенольными соединениями, синтезируемыми в механически поврежденных клетках растений . Примером таких соединений могут быть ацетосирингон 4ацетил2, 6диметоксифенол рис. Эти соединения синтезируются как ответ растения на его повреждение и их можно рассматривать как конечные метаболиты защитной природы или предшественники лигнина, выполняющего также защитную функцию в поврежденных клетках растений. Химическая природа таких сигнальных молекул растений определяет степень их способности индуцировать экспрессию генов vi области. Рис. Структура ацетосирингона. В экссудатах, выделяемых механически поврежденными клетками растений, присутствует, повидимому, смесь различных сигнальных молекул различных химических структур обладающая повышенной способностью индуцировать экспрессию генов vi области в сравнении с индивидуальными соединениями.