Молекулярно-биологическая характеристика генома вируса гепатита C (изолята 274933RU), выделенного на территории РФ

• Автор: Мохонов, Владислав Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 с.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурная организация вируса гепатита С.

1.2. Процессинг полнпротеинапредшественника ВГС.

1.3. Белки вируса гепатита С.

1.3.1. Согепротеин.

1.3.2. Гликопротеины Е1 и Е2.

1.3.3. Ыпротеин.

1.3.4. ЫЭЗпротеин.

1.3.5. А и ЫВбелки

1.3.6. 5А и ЫВбелки.

1.4. Генет ическая гетерогенность вируса гепатита С.
1.5. Получение экспрессии белков вируса гепатита С в
бактериальных системах.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Сыворотки крови.
2.2 Используемые в экспериментах олигонуклеотиды.
2.3. Работа с бактериальными культурами.
з
Используемые в работе штаммы . i.
Выращивание бактерий.
Приготовление воды, свободной от РНКаз.
Проведение иммуноферментного анализа ИФА. Неконкурентный иммуноферментный анализ.
Выделение тотальной РНК из сыворотки крови. Концентрирование вирусного материала.
Лигирование концевых последовательностей РНК вируса гепатита С с адаптерами.
Постановка реакции обратной транскрипции. Постановка полимеразной цепной реакции ПЦР. Электрофоретический анализ ДНК.
Проведение ферментативных реакций для генной инженерии.
Клонирование фрагментов кДНК вируса гепатита С.
Очистка полученных фрагментов к ДНК.
Приготовление компетентных клеток.
Трансформация плазмидной ДНК.
Селекция плазмид, несущих фрагменты генома В ГС. Выделение плазмидной ДНК.
Определение нуклеотидных последовательностей
клонированных кДНК фрагментов генома вируса гепатита С.
Секвенирование фрагментов кДК и X.
Отжиг праймера на двуцепочечную матрицу.
Проведение реакции терминирования.
Элекрофорез одноцепочечной ДНК в ПААГ. Секвенирование фрагментов кДНК 9 и , лигированных с вектором .
Экспрессия и анализ рекомбинантных белков и ВГС.
Приготовление лизата бактериальных клеток.
Выделение телец включения из клеток . i.
Очистка белка методом хроматографии на металлохелатной сефарозе.
Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле.
Проведение вестернблот гибридизации.
Компьютерная обработка данных.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ЗЛ. Циркуляция генотипов вируса гепатита С среди различных групп населения.
3.2. Анализ полной нуклеотидной последовательности генома вируса гепатита С, выделенного на территории Российской Федерации.
3.2.1. Аназиз вариабельности генома ВГС субтипа 1Ь.
3.2.2. Подбор олигонуклеотидов для амплификации фрагментов к ДИК ВГС.
3.2.3. Амлификация кДНК фрагментов генома вируса гепатита С изолята Щ.
3.2.4. Синтез кДНК, соответствующих 5 и 3терминальным участкам геномной РНК вируса гепатита С изолята 1Ш.
3.2.5. Определение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК вируса гепатита С изолята 1Ш субтипа 1Ь.
3.2.6. Анализ нуклеотидной последовательности генома и предсказанной аминокислотной последовательности полипротеинапредшественника изолята КО.
3.2.7. Филогенетический анализ изолята вируса
гепатита .
3.3. Получение рекомбинантных белков и вируса
гепатита С.
3.3.1. Конструирование рекомбинантной плазмиды,
обеспечивающей синтез белка в клетках .i.
3.3.2. Конструирование рекомбинантной плазмиды,
обеспечивающей синтез белка Е1 в клетках .i.
3.3.3. Изучение экспрессии полипептидов согс и ВГС в клетках . i.
3.3.4. Разработка методов очистки рекомбинантного белка и
3.3.5. Оценка иммунореактивности рекомбинантного и Е1.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Знание нуклеотидной последовательности ВГС предоставляет возможность создания библиотеки генов вируса, которая в последствии может быть использована при получении рекомбинантных белков. А поскольку в настоящее время первичная диагностика ВГСинфекции основывается на выявлении антител к вирусным белкам, получение рекомбинантных полипептидов и использование их в тестсистеме в качестве антигенов является актуальной проблемой. Следует отметить, что все выпускаемые иммуноферментные системы рассчитаны на обнаружение антител к белкам ВГС , 3, 4 и 5, а антитела к поверхностным гликопротеинам Е1 и Е2 в медицинской практике не определяют. Однако, согласно литературным данным, антитела к Е выявляются в , а к Е2 в . Используемые в некоторых отечественных иммунодиагностикумах пептиды, кодирующих отдельные антигенные детерминанты Е1 и Е2, обладают низкой чувствительностью. Поэтому получение рекомбинантных структурных белков ВГС является важной задачей для усовершенствования тестсистем. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы состояла в молекулярнобиологической характеристике генома изолята вируса гепатита С, относящегося к доминирующему субтипу на территории г. Москвы, и получении рекомбинантных структурных белков и . Определить частоту встречаемости маркров ВГСинфекции среди различных групп населения в г. Москве. Провести молекулярное клонирование, определение и анализ нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов генома изолята ВЕС доминирующего субтипа. Сконструировать рекомбинантные плазмиды, способные обеспечить синтез структурных белков и I вируса гепатита С в клетках ii i. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработана оригинальная схема для получения пяти перекрывающихся фрагментов генома вируса гепатита С субпипа . Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса гепатита С, относящегося к доминирующему субтипу , циркулирующего на территории Российской Федерации. Получены оригинальные рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие высокий уровень синтеза белков и в клетках ii i. Разработан простой бесколоночный метод очистки рекомбинантных белков и вируса гепатита С с степенью чистоты. Показана принципиальная возможность использования рекомбинантных полипептидов и в создании новых диагностических иммуноферментных тестсистем. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. На территории г. Москвы частота встречаемости маркеров ВГСинфекции среди первичных доноров крови, пациентов отделений гемодиализа и лиц, употребляющих внутривенно наркотические препараты равна 2. В период г. С являлся 1Ь. Определена первичная структура генома вируса гепатита С, субтипа , выделенного на территории России. Получены рекомбинантные плазмиды, детерминирующие синтез белков соге и вируса гепатита С в клетках ii i. Показана принципиальная возможность выявления антител к вирусным белкам соге и при использовании полученных полипептидов в качестве антигенов. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структурная организация вируса гепатита С. Вирус гепатита С ВГС классифицируют как отдельный род ivi в семействе vivii. Это семейство включает в себя флавивирусы, иестивирусы, а также, недавно открытые, вирусы V, V и Vвирус гепатита 1. Несмотря на то, что пока не удатся получить ВГС в количествах, позволяющих провести его исчерпывающее электронномикроскогшческос и вирусологическое изучение, определены следующие характеристики вируса вирион представляет собой частицу диаметром 3 нм, коэффициент седиментации около 0 . Исследование плавучей плотности вирионов ВГС, полученных от инфицированных больных и в культуре клеток, установило различия в их коэффициентах седиментации. Вирус, выделенный из плазмы больного острым гепатитом С и экспериментально зараженной шимпанзе, имел плавучую плотность в градиенте сахарозы 1. Считают, что более низкая плавучая плотность вирионов ВГС, полученных от инфицированных больных и от лабораторных животных, обусловлена их ассоциацией с липопротеинами низкой плотности, что, повидимому, способствует проникновению вируса в клетку. Обнаружение в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С частиц с высокой плавучей плотностью 1. ВГС с антителами 1, 5.