Транскриптрасщепляющая активность РНК-полимеразы Escherichia coli

• Автор: Орлова, Марианна Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1995
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле.

1. 1. 1. Связывание РНКполимеразы с промотором и

инициация транскрипции

1. 1. 2. Элонгация транскрипции

1. 1. 3. Терминация транскрипции

1. 2. Классическая модель структуры ТЭК и механизма

элонгации транскрипции

1. 3. Обнаружение спонтанного расщепления РНКтранскрипта

в составе ТЭК .

1. 4. Транскрипционные факторы Индуцирующие реакцию
расщепления РНКтранскрипта в составе ТЭК
1.4. 1. Транскрипционные факторы . i и
1. 4. 2. Действие и на тупиковые ТЭК
1. 4. 3. Эукариотический транскрипционный фактор II
функциональный аналог факторов
1. 5. Новые представления о структуре и динамике
элонгационных комплексов
1. 6. Заключение.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.2. Питательные среды и антибиотики.
2.3. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2.4. Выделение плазмидной ДНК
2.5. Использование ферментов в молекулярном клонировании
2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот
и белков.
2.6.1. Неденатурирующий электрофорез ДНК и выделение
фрагментов ДНК из гелей.
2. 6. 2. Денатурирующий электрофорез РНК.
2. 6. 3. Денатурирующий электрофорез белков
2. 7. Олигонуклеотиды и определение первичных
последовательностей ДНК.
2. 8. Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2. 9. Получение плазмид рМОА и i, свехпродуцирующих
и 6i.Г
2. . Получение плазмид рМ.4 и .4i,
свехпродуцирующих и 6i
2 Конструирование гибридных и дгеВдгеА генов и получение плазмид, сверхпродуцирующих
соответствующие гибридные белки.
2. . Получение препарата реконституированной
РНКполимеразы.
2. . Выделение РНКполимеразы из клеток . i .
2. . Сверхпродукция и выделение .
2. . Сверхпродукция и выделение .
2. . Получение и .
2. . Получение .
2. . Сверхпродукция и выделение 6i и 6i
2. . Транскрипция i vi получение индивидуальных ТЭК.
2. . Тесты на транскриптрасщепляющую и антитупиковую
активности.
2. . Транскрипция с помощью РНКполимеразы,
иммобилизованной на i2 агарозе.
2. . Фотохимическое сшивание и с 9ТЭК.
2. . Картирование участка сшивки и с 9ТЭК.
2. . 1. Картирование
2. . 2. Картирование .
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3. 1. Собственная транскриптрасщепляющая активность
РНКполимеразы . i.
3. 1. 1. Получение мутантного штамма . i.
Анализ грубого клеточного лизата этого штамма на антитупиковую и транскриптрасщепляющую
активности.
3. 1.2. Обнаружение собственной транскриптрасщепляющей
активности РНКполимеразы . i
3. 1.3. Щелочные индуцируют собственную
транскриптрасщепляюицую активность РНКполимеразы.
3. 1.3. 1. Щелочные индуцируют расщепление транскрипта РНКполимеразой как по типу ,
так и по типу .
3. 1. 3. 2. Щелочные оказывают влияние на тупиковые
элонгационные комплексы
3. 1.3. 3. Предполагаемый механизм транскриптрасщепляющей активности РНКполимеразы . i
3. 2. Физикохимические свойства транскрипционных факторов и , их взаимодействие с РНК
полимеразой и с ТЭК.
3. 2. 1. Получение штаммов продуцентов и
3. 2. 2. Физикохимические свойства и .
3. 2. 3. Связывание и с кор и холо
РНКполимеразой и с ТЭК
3. 3. Стркуктурнофункциональные свойства
транскрипционных факторов и .
3. 3. 1. Фотохимическое сшивание и с
РНКтранскриптом в ТЭК.
3. 3. 2. Картирование участков и , контактирующих
с Зконцевым нуклеотидом РНК
3. 3. 2. 1. Картирование вгеА
3. 3. 2. 2. Картирование вгеВ
3. 3. 3. Ыконцевые домены вгеА и вгеВ определяют их
функциональную специфичность
3. 3. 4. Трехмерная структура ОгеА и вгеВ
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


ВВЕДЕНИЕ. ГЛАВА 1. Краткие сведения о транскрипционном цикле. ТЭК . Транскрипционные факторы . Заключение. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Бактериальные штаммы и плазмиды. Питательные среды и антибиотики. ДНК из гелей. Денатурирующий электрофорез РНК. ДНК. Полимеразная цепная реакция ПЦР. Получение плазмид рМ. РНКполимеразы. Выделение РНКполимеразы из клеток . Сверхпродукция и выделение . Сверхпродукция и выделение . Получение и . Получение . Транскрипция i vi получение индивидуальных ТЭК. Фотохимическое сшивание и с 9ТЭК. Картирование участка сшивки и с 9ТЭК. Картирование . ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. РНКполимеразы . Получение мутантного штамма . РНКполимеразы . РНКполимеразы. Предполагаемый механизм транскриптрасщепляющей активности РНКполимеразы . ТЭК. Физикохимические свойства и . РНКтранскриптом в ТЭК. ВЫВОДЫ. Актуальность проблемы. Одной из наиболее важных задач молекулярной биологии является изучение механизмов экспрессии генетической информации. Ключевой этап этого процесса транскрипция заключается в комплементарном синтезе РНКтранскрипта на ДНКматрице. Бактериальный транскрипционный цикл удается целиком осуществить в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНКматрицы, очищенной РНКполимеразы и рибонуклеотидов, без каких бы то ни было дополнительных белковых факторов. Тем не менее, РНКполимераза не является единственным белком, участвующим в транскрипции i viv. В ней также участвуют разнообразные регуляторные и вспомогательные белки, изучение которых важно для детального понимания процесса транскрипции в живой клетке. В процессе удлиннения транскрипта РНКполимераза движется по ДНКматрице с непостоянной скоростью. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНКполимеразы, так называемые паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. РНКполимераза может также попадать в элонгационные тупики состояние, при котором, несмотря на целостность тройного элонгационного комплеса РНКполимеразаДНКматрицаРНКтранскрипт, полностью блокируется нормальный процесс удлиннения РНК.