Исследование пространственной структуры уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium и её комплексов с аналогами субстратов

• Автор: Донцова, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 110 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Часть 1. Характеристика нуклеозидфосфорилаз из

различных видов организмов.

1. Введение.

2.1. Нуклеозидфосфорилазы, мономер которых состоит

из одного домена.

2.1.1. Общая характеристика

2.1.2. Аминокислотные последовательности.

2.1.3. Рентгеноструктурные исследования

2.1.4. Активный центр

2.2. Нуклеозидфосфорилазы, мономер которых состоит
из двух доменов
2.2.1. Общая характеристика
2.2.2. Аминокислотные последовательности.
2.2.3. Рентгеноструктурные исследования
2.2.4 Активный центр
3. Заключение
Часть 2. Методы кристаллизации белков
1. Введение.
2.1. Кристаллизация в объеме.
2.2. Кристаллизация диализом.
2.3. Кристаллизация методом диффузии паров растворителя
2.4. Кристаллизация на подложке
2.5. Кристаллизация в геле
2.6. Кристаллизация в невесомости
2.7. Кристаллизация в центрифуге.
3. Автоматизация экспериментов по кристаллизации
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Материалы
1.1. Химические материалы.
1.2. Биологические материалы
2. Методы.
2.1. Выделение и очистка уридинфосфорилазы
ii.
2.2. Кристаллизация уридинфосфорилазы . ii
2.3. Кристаллизация уридинфосфорилазы . ii в
комплексе с аналогами субстратов
2.4. Получение наборов дифракционных данных.
2.5. Определение структуры уридинфосфорилазы . ii.
2.6. Определение структуры уридинфосфорилазы . ii
в комплексе с аналогами субстратов.
2.6.1. Комплекс уридинфосфорилазы . ii с
урацилом и ионом сульфата.
2.6.2. Комплекс уридинфосфорилазы . ii с уридин
5монофосфатом и ионом сульфата
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение гомогенного препарата уридинфосфорилазы
. ii
2. Кристаллизация уридинфосфорилазы . ii
3. Кристаллизация уридинфосфорилазы . ii
в комплексе с аналогами субстратов
4. Сбор дифракционных данных с кристаллов уридинфосфорилазы
. ii и определение пространственной структуры фермента
5. Структуры уридинфосфорилазы . ii.
.
Д
6. Активный центр фермента.
6.1. Место связывания урацила.
6.2. Место связывания иона фосфата .
6.3. Место связывания рибозы
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ВВЕДЕНИЕ


К настоящему моменту наиболее изученными являются пуриновые нуклеозидфосфорилазы и тимидинфосфорилазы. Последние данные об исследованиях нуклеозидфосфорилаз приведены в первой части литературного обзора данной диссертации. Существование уридинфосфорилаз впервые было установлено в году 1, но до сих пор эти ферменты остаются наименее изученными. Одним из подходов к установлению механизма действия ферментов является сравнительное изучение особенностей структурнофункциональной организации этих белков, выделенных из различных организмов. До настоящего момента была известна только пространственная структура уридинфосфорилазы ii i. Это была первая пространственная структура для ферментов данного типа. Было показано, что фермент состоит из шести одинаковых мономеров молекулярной массой кДа. Каждый мономер представляет собой однодоменный белок схр типа. В настоящей диссертации изучалась структура уридинфосфорилазы ii. При сходстве аминокислотных последовательностей уридинфосфорилаз . Е. i, тем не менее, наблюдается существенное отличие в их ферментативных свойствах. В частности, уридинфосфорилаза . Е. i. Кроме того, уридинфосфорилаза . Е. i, сродством ко всем исследованным субстратам. Например, уридинфосфорилаза . Е. i 2. Целью настоящей работы являлось определение пространственной
структуры уридинфосфорилазы . Ранее в научноисследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов была создана плазмида, несущая ген уридинфосфорилазы 5. Мтипит, и получен штаммсуперпродуцент фермента. Ытипит в препаративных количествах. Полученный белок был охарактеризован по подвижности в гельэлектрофорезе в присутствии 8 и в неденатурирующих условиях. Был проведен поиск условий кристаллизации и получены пригодные для рентгеноструктурного анализа две кристаллические формы фермента уридинфосфорилазы 5. Ытипит. IурЫтипит с аналогами субстратов ионом фосфата, урацилом и уридин5монофосфатом. Ли 1. С использованием полученных наборов дифракционных данных были определены пространственные структуры нативного фермента и его комплексов с перечисленными выше соединениями. Полученные структуры позволили охарактеризовать активный центр фермента. Литературный обзор данной работы состоит из двух частей. Первая часть посвящена общей характеристике нуклеозидфосфорилаз. Подробно описана история открытия этих ферментов, первые исследования механизма катализа, а также новые данные о пространственных структурах нуклеозидфосфорилаз из различных организмов. Вторая часть литературного обзора посвящена методам кристаллизации. ЧАСТЬ 1. Нуклеотиды и нуклеотидные предшественники включены в большинство биохимических процессов, происходящих в живой клетке. Способность клеток поддерживать постоянный запас пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов зависит от процесса их синтеза, который может происходить двумя путями. Один путь это синтез нуклеотидов из основных компонентов углерода, водорода, кислорода, азота, фосфора, связанный с большими энергетическими затратами. Второй путь менее энергоемкий синтез из имеющихся готовых фрагментов. Нуклсозидфосфорилазы осуществляют фосфоролиз пуриновых и пиримидиновых оснований, и обеспечивают клетку предшественниками нуклеотидов, тем самым составляют альтернативу синтезу нуклеотидов v. Фосфоролиз заключается в расщеплении гликозидной связи ионом фосфата с образованием свободного основания и рибоза1 фосфата. Впервые энзиматическое расщепление гликозидной связи в пуриновых и пиримидиновых рибозидах было описано v i в году 3. В году v опубликованы данные об общих свойствах и методах выделения из различных органов собаки нуклеозидаз так были названы эти ферменты 4, 5. Было показано существование двух обособленных типов нуклеозидаз один специфичный для пуринов и другой для пиримидинов, но при этом замечено, что не происходит расщепления цитидина 3. В году в экспериментах , с использованием пиримидиновой нуклеозидфосфорилазы из печени крысы, было показано наличие второго продукта реакции рибозаГфосфата, вместо рибозы, как было ранее предположено 6.