Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов

• Автор: Патрушев, Максим Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 107 с. : ил.

Введение,.

Часть I. Обзор литературы,

Глава I, Структура, функции и физиология митохондрий млекопитающих

1.1. Специфика генетической системы митохондрий в

1.2. Структура, содержание генов, н организация мтДНК млекопитающих

1.3. Транскрипция мтДНК и процессинг РНК

1.4. Репликация мтДНК

Регуляция экспрессии и репликации мтДНК

1.5. Нуклеазная активность в митохондриях

1.6. Митохондриальная РТР

Гпава 2, Дисфункция митохондрий и нестабильность мтДНК при действии генотоксичеких агентов облучения и блеомицина
2.1. Действие облучения
2.2.Структура и принцип действия антибиотика блеомицина
2.3. Апоптоз
Роль митохондрий в апоптозе.
Глава 3. Происхождение и эволюция митохондрий
Часть II Собственные исследования
Глава 1. Материалы и методы,.
1.1. Лабораторные животные
1.2. Облучение ММН9М9М9НММИММММ9М9М9НН9М9ММ9ЖМММММ9ИМ9И9Н9 . Выделение митохондрий мозга 1НМЖ9МНМЖНМН9ММ1МИ9М1МММ1М9ММЖ1М1
1.4. Измерение скорости потребления в суспензии изолированных митохондрий
МОЗГа. Ж9ИМИЖИ1МНЖМ1МНЖ9МЖИ1ЖЖ1Н1М1ЖЖЖЖЖМ1ЖЖМ1М9ЖЖНЖММ
. Измерение АРт ИИМНЖ1МННШННИМ9ИМ1НЖМИНИ9НМММЖНМЖМЖНМ1Н9М9ЖННН1М
1.6. Выделение ДИК И1ЖИЖНЖЖМЖМ9МИЖ9Ж9ЖЖММЖ9ММЖМв1Ж9МЖММЖНМ
1.6.1. Выделение ДНК из митохондрий
1.6.2. Выделение ДНК из цитозольной фракции сорбция на магнинтых сорбентах.
1.7. Выделение РНК ЖЖИЖИММНЖЖЖНИНМНИЦМИМ
1.7.1. Выделение РНК с использованием тиоцианата гуанидина.
1.7.2. Выделение РНК на магнитных сорбентах
1.7.3. Выделение мРНК из тотальной РНК.
1.8. Синтез первой цепи кДНК ММЖЖМЖЖЖ9ЖЖЖ9НЖ1МММЖНМ1ЖМЖ9Ж9Ж
1.9. Полимеразная цепная реакция ПЦР ИИЖЖ9ЖЖМИЖЖ9ЖИМЖЖЖЖЖ
1.9.1. ПЦР в реальном времени.
1.9.1.1. Краткая теория метода ПЦР в реальном времени.
1 Определиие нуклсазной активности МЖ9НЖЖНМ1Ж1аЖЖММЖ1МЖНМИММ1
1 Определение активности цнтратсинтазы Ж9ЖЖЖ1На1ЖЖЖЖЖ9ММЖМ9
Глава 2, Результаты и их обсуждение
2.1.Бногенез мтДНК в ответ на действие облучения и блеомицина МЖЖ9НЖЖЖ
2.1.1.Количество копий мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей
2.1.2. Репликация мтДНК при действии ИР
2.1.3. Транскрипция мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей.
2.1.4 Транскрипция мтДНК при действии ИР
2.1.5. Транскрипция мтДНК при действии блсомицина.
2.2. Элиминация фрагментов мтДНК
2.2.1. Выход ДНК из митохондрий i vi
2.2.2 Выход фрагментов мтДНК из митохондрий в тканях облученных мышей i viv.
Функциональное состояние митохондрии тканей облученных мышей
2.4. Эндонуклеаза и ее роль в фрагментации мтДНК Ж1ж1и1жммм1нм1мммммжамм
Заключение.
Выводы.
Список цитированной литературы


Представленная работа посвящена исследованию функционирования мтДНК в условиях окислительного стресса, индуцированного ионизирующим излучением и действием цитостатического антибиотика блеомицина. Индукция окислительного стресса внешними физическими и химическими факторами рассматривается как модельная система, усиливающая процессы повреждения мтДНК. Часть I. Обзор литературы. Глава 1. Известно, что большинство клеток млекопитающих содержит сотни митохондрий, а каждая митохондрия содержит несколько 2 копий мтДНК . У одного организма все копии мтДНК должны быть идентичны состояние гомоплазмии, однако мутации могут накапливаться, сохраняться и даже амплифицироваться, что приводит к сосуществованию диких немутированных и мутированных форм мтДНК состояние гетероплазмии. При каждом делении клетки митохондрии и их геномы случайным образом распределяются в дочерние клетки. В связи с этим каждая из дочерних клеток на ранних стадиях клеточного цикла обладает своим собственным уровнем гетеро или гомоплазмии. Как следствие этого пороговый эффект в возникновении мтДНКзависимых болезней человека в большинстве случаев, для возникновения патологии, уровень мутантных молекул мтДНК должен превышать от общего числа копий мтДНК i . Митохондриальный геном наследуется по материнской линии несколько митохондрий сперматазоида, которые смогли пройти через мембрану яйцеклетки во время оплодотворения, активно элиминируются убиквитинзависимым механизмом v . Данные более поздних исследований показывают, что в некоторых случаях, отцовская мтДНК может избегать процесса активной элиминации и передаваться потомкам, как например, в мышечной ткани Vii, . Во время оогенеза происходит процесс, названный бутылочное горло, суть которого заключается в том, что лишь небольшая часть молекул мтДНК передается потомкам i . Этот феномен закрепляет мутации в состоянии гомоплазмии в течение одного или нескольких поколений vii i, . Скорость эволюции мтДНК намного быстрее, чем ядерного генома . Косвенным подтверждением этому является то, что мтДНК меньше защищена белками и физически ассоциирована с внутренней мембраной митохондрий, в которой генерируется большое количество повреждающих мтДНК активных форм кислорода АФК. Высокий уровень мутабельности и материнская наследуемость делает анализ последовательности мтДНК интересным инструментом в популяционной генетике человека и изучение эволюции i, . С другой стороны, накопление соматических мутаций мтДНК, как было подтверждено играет большую роль в старение человека , ii . Отличительной особенностью мтДНК является и то, что гены мтДНК транслируются с использованием генетического кода, несколько отличного от универсального. Так, у млекопитающих кодон , кодирующий триптофан в мтДНК, в ядерной ДНК является терминирующим , и являются инициирующими кодонами, и вместо кодирования аргинина являются терминирующими. Более того, упрощенная система кодонантикодонового взаимодействия в трансляции задействует только тРНК i , . Структура, содержание генов, и организация мтДНК млекопитающих. Структура, содержание генов и организация мтДНК строго консервативны для всех млекопитающих. В связи с этим, мтДНК можно рассматривать как единую модель. ДНК млекопитающих это замкнутая в кольцо двуцепочечная молекула, размером приблизительно ,6 т. ДНК большинства клеток составляет не более 0, от тотальной ДНК клетки. Изза того, что содержание отличается у двух цепей мтДНК, они могут быть разделены на Нцепь от англ. В нормальном состоянии мтДНК представлена в суперскрученной форме, и, как было сказано выше, слабо ассоциирована с белками, в отличие от ядерной ДНК i . Ранее предполагалось, что мтДНК человека ассоциирована с внутренней мембраной митохондрий через белок i . Однако в недавних работах, проведенных на дрожжевых клетках, показано, что мтДНК вместе с белками образует надмолекулярные структуры, названные нуклеоидами, содержащими несколько молекул мтДНК и около различных полипептидов i . Вся эта структура, в свою очередь, ассоциирована с внутренней мембраной . Большая часть молекул мтДНК в метаболитически активных клетках имеет трехцепочечную структуру, названную петлей i , образованную участком Нцспи длиной п.