Дуплекс - специфическая нуклеаза из гепатопанкреаса камчатского краба

• Автор: Щеглов, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 78 с. : ил.

1. Введение.
Значение нуклеаз для современной биологии сложно переоценить. С одной стороны, нуклеазы представляют собой очень интересный и важный объект исследования. Любой живой организм содержит несколько разных нуклеаз, играющих существенную роль в его жизни. В настоящее время известно множество типов нуклеаз - от высокоспецифичных эндонуклеаз рестрикции, атакующих строго определенные последовательности ДНК, до ДНК, РНК-неспецифичных экзо- эндо- нуклеаз, гидролизующих не только нуклеиновые кислоты, но и нуклеотид-три-фосфаты. Ферменты этой группы являются ключевыми участниками таких биологически важных процессов как репликация, репарация, рекомбинация (в том числе транспозиция), регуляция экспрессии генов, защита от вирусов, апоптоз, а так же пищеварение. Ученые, изучающие любой из перечисленных процессов, уделяют немало внимания различным нуклеазам. Но, помимо этого, изучение самих нуклеаз, их молекулярной организации, механизмов взаимодействия с субстратом, основ специфичности - очень интересная научная работа. С другой стороны, именно использование нуклеаз произвело настоящую революцию в методах молекулярной биологии. Молекулярное клонирование, позволившее на много порядков увеличить наши знания о живой природе, основано на применении высоко специфичных нуклеаз - эндо нуклеаз рестрикции. Так же на основе использования различных нуклеаз были созданы широко распространенные изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и другие. Но, при этом, новые нуклеазы с новыми свойствами могут служить основой для создания новых методов молекулярной биологии. Поэтому поиск и изучение новых нуклеаз представляет собой научно интересное и практически значимое исследование. Данная работа посвящена изучению нуклеазы из гепатопанкреаса камчатского краба (дуплекс - специфичной нуклеазы, или ДСН). Нами был клонирован ген, кодирующий этот фермент, разработан препаративный метод выделения нативного белка в чистом виде, и охарактеризованы его свойства. Наиболее интересньми из оных являются термостабильность и высокая оптимальная температура катализа, а так же субстратная специфичность - ДСН гидролизует только двух цепочечную ДНК или цепь ДНК в ДНК-РНК гибридах. Эти свойства делают возможным разработку уникальных молекулярнобиологических методов на основе ДСН. Кроме того, первичная структура ДСН гомологична первичной структуре ДНК, РНК неспецифичных эндонуклеаз. Ферменты этой группы гидролизуют как РНК, так и ДНК, как дву, так и одно цепочечную. Нами впервые было показано, что среди ферментов этого подсемейства возможны исключения -высокоспецифичные нуклеазы.

2. Обзор литературы: «Неспецифические РНК, ДНК — эндонуклеазы».
2.1 Нуклеазы и их место в классификации ферментов.
Во всех живых организмах генетическая информация хранится и реализуется посредством нуклеиновых кислот. Все живые организмы содержат набор ферментов, осуществляющих синтез, модификацию, репарацию и деградацию нуклеиновых кислот. Зачастую один фермент может осуществлять несколько ферментативных реакций - как, например, и синтез, и деградацию ДНК. Среди этого разнообразия выделяют нуклеазы - ферменты, гидролизующие фосфодиэфирные связи между сахарными остатками нуклеотидов нуклеиновых кислот. Нуклеазы широко представлены в различных живых организмах и принимают участие в таких процессах как репликация, репарация, рекомбинация (в том числе транспозиция), регуляция экспрессии генов, защита от вирусов, апоптоз, а так же пищеварение. На основе использования различных нуклеаз (прежде всего эндонуклеаз рестрикции) были созданы широко распространенные методы молекулярного клонирования, изучения ДНК-белковых взаимодействий, определения структуры нуклеиновых кислот и другие. Современная классификация учитываем следующие параметры нуклеаз (1,2,3; 4):
1. Тип субстрата - ДНК или РНК;
2. Положение атакуемой нуклеотидной связи - крайнее в цепи ДНК (РНК) (экзонуклеазы) или наоборот (эндонуклеазы);
3. Тип продукта реакции - мононуклеотиды или олигонуклеотиды;
4. Тип гидролизуемой связи - между 5/ или 3/ атомом сахарного остатка и фосфатом.
С учетом всех этих параметров схема классификации нуклеаз выглядит следующим образом
(5; 4):
Нуклеазы
ДНК, РНК специфичные нуклеазы
ДНК, РНК неспецифичные нуклеазы
Рибонуклеазы (РНКазы) Дезоксирибонуклеазы (ДНКазы)
Экзорибонуклеазы Экзодезоксирибонуклеазы
Экзонуклеазы
Эндорибонуклеазы Эндодезоксирибонуклеазы
Эндонуклеазы
Эндонуклеазы рестрикции
Эндо-экзонуклеазы
Эндонуклеазы хоуминга
Дезоксирибонуклеазы, специфичные к поврежденной ДНК
Рис. 1. Схема классификации нуклеаз (4, 5).

ДНКазной активности, тогда как в контрольном образце ДНКазная активность отсутствовала (см. рис 16). гп 1 2 3
Рисунок 16. Деградация высокомолекулярной ДНК под действием рекомбинантной нуклеазы камчатского краба, под действием ее же после обработки протеиназой К при 37 и 60 °С.
1. Контроль (pet 22b+) без протеиназы К
2. ДСН без протеиназы К.
3. Контроль (pet 22b+) после обработки протеиназой К.
4. ДСН после обработки протеиназой К.
Сконцентрировав полученный белок, мы протестировали его активность по отношению к д.ц. ДНК и о.ц. ДНК. В качестве о.ц. ДНК использовался ДНК фага М13, в качестве д.ц. ДНК - ДНК фага лямбда. Как видно из рисунка 17, ДНК фага лямбда деградирует под действием фермента, тогда как ДНК фага М13 остается неизменной. Из этого следуют, что клонированная нами кДНК кодирует новую, д.ц. ДНК специфичную нуклеазу (дуплекс -специфичную нуклеазу, или ДСН).